Der HPLC-Experte E-Book

• Herausgeber: Wiley-VCH
• Kategorie: Wissenschaft und neue Technologien
• Sprache: Deutsch

Seitenzahl: 609

Veröffentlichungsjahr: 2014

Beschreibung

Der rasanten Entwicklung auf dem Gebiet der HPLC wird mit diesem Buch Rechnung getragen: Von Gradientenoptimierung über Kopplungs- und 2D-Techniken bis zu Dokumentation und Informationsbeschaffung - aktuell und kompakt geschrieben von Praktikern für Praktiker.


Inhalt:
1 LC/MS-Kopplung
1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung
1.2 Technische Aspekte und Fallstricke der LC/MS-Kopplung
1.3 LC/MS-Kopplung - ein praktisches Beispiel aus der Ionenchromatographie
2 HPLC-GC-Kopplung in der Praxis; Theorie, Applikationsbeispiele und Ausblick
3 Optimisierungsstrategien in der RP-HPLC
4 Der Gradient in der RP-Chromatographie
4.1 Aspekte der Gradienten-Optimierung
4.2 Vorhersagen von Gradienten
5 Vergleich und Auswahl von modernen HPLC-Säulen
6 Trenntechniken in der Biochromatographie
7 Moderne HPLC-Softwareprogramme - Eigenschaften, Vergleich, Ausblick
8 Möglichkeiten der "richtigen" Integration heute
9 HPLC im reglementierten Bereich
9.1 Intelligente Dokumentationen
9.2 Tipps für eine gelungene FDA-Inspektion
10 Effiziente Informationsbeschaffung im Zeitalter von Web 2.0 am Beispiel der HPLC
11 Trends in der Detektionstechnik

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Vorwort

Zum Aufbau des Buches

Autorenverzeichnis

1 LC/MS-Kopplung

1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung

1.2 Technische Aspekte und Fallstricke der LC/MS-Kopplung

1.3 LC/MS-Kopplung in der Praxis – Anwender berichten

2 HPLC-GC-Kopplung in der Praxis: Grundlagen, Applikationsbeispiele und Ausblick

2.1 Einleitung

2.2 Allgemeiner Aufbau

2.3 LC-GC oder LC×GC – Heartcut vs. Comprehensive

2.4 HPLC als Vortrennung für die GC

2.5 Instrumentelle Anforderungen an die HPLC

2.6 LC-GC-Transfer und Echtzeitverdampfung

2.7 PTV-Solvent-Split

2.8 Geschwindigkeitskontrollierte Injektion

2.9 At-Once-Injection/Rapid LV-Injection

2.10 On-Column-Techniken

2.11 Alternative On-Column-Transfertechniken

2.12 Solvent Trapping und Bandenverbreiterung

2.13 Der frühe Dampfausgang (SVE)

2.14 Simultane Lösungsmittelverdampfung (concurrent solvent evaporation)

2.15 Partiell simultane Lösungsmittelverdampfung (partially concurrent solvent evaporation)

2.16 Erfahrungen aus der Praxis und Fehlersuche

2.17 Anwendungsbeispiele

2.18 Fazit und Ausblick

3 Optimierungsstrategien in der RP-HPLC

3.1 Einführung

3.2 Grundlagen

3.3 Methodik der Optimierung

3.4 Ausblick

4 Der Gradient in der RP-Chromatographie

4.1 Aspekte der Gradientenoptimierung

4.2 Vorhersage von Gradienten

5 Vergleich und Auswahl von modernen HPLC-Säulen

5.1 Trägermaterialien

5.2 Stationäre Phasen für die HPLC – die geschichtliche Entwicklung

5.3 pH-Stabilität und Restriktionen beim Einsatz von Kieselgel

5.4 Die Kerneigenschaften von Umkehrphasen

5.5 Charakterisierung und Klassifizierung von Umkehrphasen

5.6 Vorgehensweise bei der Methodenentwicklung in der Praxis

5.7 Säulenscreening

5.8 Säulendatenbanken

6 Trenntechniken in der Biochromatographie

6.1 Einleitung

6.2 Übersicht stationäre Phasen

6.3 Reversed Phase-Chromatographie von Peptiden und Proteinen

6.4 IEX-Chromatographie von Peptiden und Proteinen

6.5 Size-Exclusion-Chromatographie von Peptiden und Proteinen

6.6 Weitere Chromatographiearten – Kurzbeschreibungen

6.7 Zusammenfassung und Ausblick

7 Vergleich moderner Chromatographie-Datensysteme

7.1 Einleitung

7.2 Die Vorläufer der CDS

7.3 Das CDS heute

7.4 Tabellarischer Vergleich von Empower und Chromeleon sowie OpenLAB CDS

7.5 Das CDS von morgen

7.6 Das CDS in 20 Jahren

8 Möglichkeiten der Integration heute

8.1 Peaküberlagerung – Auswirkung auf das Chromatogramm

8.2 Abtrennmethoden für überlagerte Peaks

8.3 Anwendung der Abtrennmethoden

8.4 Chromatogrammsimulation

8.5 Dekonvolution

8.6 Evaluierung von Abtrennmethoden

8.7 Praktische Anwendung der Dekonvolution

9 HPLC im reglementierten Bereich

9.1 Intelligente Dokumentation

9.2 Tipps für eine gelungene FDA-Inspektion

10 Effiziente Informationsbeschaffung im Zeitalter von Web 2.0 am Beispiel der HPLC

10.1 Suchmaschinen: Möglichkeiten und Grenzen

10.2 Spezielle Suchdienste

10.3 Suche nach Fachinformationen

10.4 Welche Mehrwerte bieten Firmenseiten?

10.5 Kostenpflichtige Inhalte

10.6 Apps für Tablets und Mobiltelefone

10.7 Einsatzmöglichkeiten sozialer Netzwerke

10.8 Prognose: Wie werden sich soziale Netzwerke entwickeln?

10.9 Wie kann man sich über aktuelle Neuigkeiten auf dem Laufenden halten?

11 Trends in der Detektionstechnik

11.1 Einführung und Funktionsprinzip von Aerosoldetektoren

11.2 Gemeinsame Charakteristika, Vor- und Nachteile der einzelnen Detektoren

Stichwortverzeichnis

Beachten Sie bitte auch weitere interessante Titel zu diesem Thema

Röpke, W.

Der HPLC-Schrauber

2013

978-3-527-31817-9

Meyer, V.R.

Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern

3. Auflage

2010

978-3-527-31268-9

Mascher, H.

Klinische Analytik mit HPLC

Ein Ratgeber für die Praxis

2010

978-3-527-32751-5

Kaltenböck, K.

Chromatographie für Einsteiger

2008

978-3-527-32119-3

Kazakevich, Y.V., LoBrutto, R. (Hrsg.)

HPLC for Pharmaceutical Scientists

2007

978-0-471-68162-5, auch als e-Books

erhältlich

Autor

Dr. Stavros Kromidas

Consultant, Saarbrücken

Rosenstr. 16

66125 Saarbrücken

Deutschland

Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung

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Satz Reemers Publishing Services GmbH, Krefeld

Umschlaggestaltung Formgeber, Mannheim

Print ISBN: 978-3-527-33306-6

ePDF ISBN: 978-3-527-67660-6

ePub ISBN: 978-3-527-67658-3

Mobi ISBN: 978-3-527-67659-0

oBook ISBN: 978-3-527-67661-3

Vorwort

Der HPLC-Anwender findet heute erfreulicherweise viele gute Lehrbücher zur HPLC-Methodik. Auch anwendungsbezogene Literatur z. B. zur Pharma-Analytik, zu Techniken wie der UHPLC oder der Gradientelution werden offeriert.

Im vorliegenden Buch spannen wir einen Bogen über verschiedene Themen der modernen HPLC: Wir möchten aktuelle Entwicklungen aufzeigen und gehen ferner auf Techniken ein, welche unlängst den Weg in das HPLC-Labor gefunden haben oder denen dies alsbald bevorsteht.

Parallel dazu bieten wir Wissen in komprimierter Form an. In 11 Kapiteln wenden sich Fachleute an den erfahrenen Anwender und den praxisorientierten Laborleiter, die auf der Suche nach fundiertem (Hintergrund-)Wissen und neuen Erkenntnissen sind. Unser Ziel ist es, zum einen den Leser auf – ihm unbekannte – Fehler hinzuweisen und zum anderen ihm aktuelle Infos und Tipps anzubieten, die in dieser verdichteten Form nur unter erheblichem Aufwand zu erhalten sind. Ich hoffe, dass die Themenwahl die Zustimmung der Leserschaft findet.

Mein herzlicher Dank gilt den Kollegen, die ihre Erfahrung und ihr Wissen zur Verfügung gestellt haben. WILEY-VCH und speziell Frank Weinreich danke ich für die besonders gute Zusammenarbeit.

Saarbrücken, November 2013

Stavros Kromidas

Zum Aufbau des Buches

Das Buch enthält folgende Kapitel:

Kapitel 1 (LC/MS-Kopplung) ist der wichtigsten Kopplungstechnik der modernen HPLC gewidmet. Oliver Schmitz gibt im ersten Teil einen Überblick über den Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung und stellt die unterschiedlichen Modi gegenüber. Im zweiten Teil zeigt Markus Martin Fallstricke der LC/MS-Kopplung auf und gibt konkrete Hinweise, wie die LC/MS-Kopplung im Alltag erfolgreich eingesetzt werden kann. LC/MS-Kopplung wird oft mit Life Science und Umweltanalytik in Verbindung gebracht. Alban Muller und Andreas Hofmann zeigen hier als etwas ungewohnte Anwendung ein praktisches Beispiel aus der Ionenchromatographie.

Bei komplexen Proben und „schwierigen“ Matrices stößt die Kopplung Chromatographie-Spektroskopie häufig an ihre Grenze, die Kopplung zweier Trenntechniken könnte eine Alternative sein. Marco Nestola und Erik Becker berichten in Kapitel 2 aus der praktischen Sicht eines Auftragsinstituts über die HPLC-GC-Kopplung in der Praxis sowie über Theorie, Applikationsbeispiele und Ausblick.

In Kapitel 3 gehen Frank Steiner, Stefan Lamotte und Stavros Kromidas ausführlich auf Optimierungsstrategien in der RP-HPLC ein und diskutieren anhand von ausgesuchten Beispielen, welche Parameter jeweils Erfolg versprechend erscheinen.

Kapitel 4 beschäftigt sich mit der Gradientelution; Stavros Kromidas, Frank Steiner und Stefan Lamotte besprechen im Teil 1 in verdichteter Form Aspekte der Gradientenoptimierung und bieten einfache „To-do“-Regeln an. Im Teil 2 zeigt Hans-Joachim Kuss, dass mit EXCEL Vorhersagen von Gradienten sehr treffsicher sein können und das oft benutzte lineare Modell eine vereinfachte Näherung darstellt.

Im Kapitel 5 geht es um Vergleich und Auswahl von modernen HPLC-Säulen; Stefan Lamotte, Stavros Kromidas und Frank Steiner geben einen Überblick über die unterschiedlichen Säulen und machen – auf verschiedene Fragestellungen bezogene – Vorschläge für pragmatische Säulentests und Säulenportfolios.

In Kapitel 6 stellt Jürgen Maier-Rosenkranz Trenntechniken in der Biochromatographie vor, geht auf deren Spezifika im Vergleich zu der RP-HPLC ein und bespricht Vor- und Nachteile der einzelnen Modi.

Auswerteprogramme haben unterschiedliche Stärken, Umfänge und Möglichkeiten. Arno Simon zeigt in Kapitel 7, Vergleich moderner Chromatographie-Datensysteme, als neutraler Insider Vor- und Nachteile der bekanntesten Software-programme auf.

Bei der Integration von nicht basisliniengetrennten Peaks kann es zu enormen, oft nicht erkannten Fehlern kommen. In Kapitel 8, Möglichkeiten der „richtigen“ Integration heute, stellt Mike Hillebrand u. a. zwei Softwaretools vor, mit deren Hilfe sowohl die Abweichung vom Sollwert objektiv festgestellt als auch die „richtige“ Peakfläche ermittelt werden kann.

Kapitel 9 handelt von der HPLC im reglementierten Bereich. Im ersten Teil beschreibt Stefan Schmitz verschiedene Möglichkeiten und gibt Praxistipps für eine intelligente Dokumentation. Iris Retzko und Stefan Schmitz zeigen im zweiten Teil in ihren Tipps für eine gelungene FDA-Inspektion, welche entscheidende Rolle Psychologie und einfache Tricks dabei spielen.

Da intelligentes Beschaffen von Informationen nicht nur bei Geheimdienstlern von enormer Bedeutung ist, lautet das Thema von Torsten Beyer: Effiziente Informationsbeschaffung im Zeitalter von Web 2.0 am Beispiel der HPLC. Im Kapitel 10 führt er spezielle Suchdienste für Fachinformationen auf und kommentiert zusätzlich die Qualität der Quellen.

Bei isobaren Verbindungen tut sich die MS-Kopplung schwer; manches interessante Molekül ist zudem nicht UV-aktiv und der Brechungsindexdetektor kommt schließlich ob der Notwendigkeit einer Gradientelution als Detektor ebenfalls nicht infrage. Im Kapitel 11, Trends in der Detektionstechnik, gibt Stefan Lamotte einen kompakten Überblick über Aerosoldetektoren und stellt ihre Vor- und Nachteile vor.

Das Buch muss nicht linear gelesen werden. Die einzelnen Kapitel wurden so verfasst, dass sie abgeschlossene Module darstellen – ein „Springen“ ist jederzeit möglich. Damit haben wir versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlagewerk gerecht zu werden. Der Leser möge davon profitieren. Zum Schluss noch Folgendes: Mancher Leser möchte vielleicht das EXCEL-Makro von Hans-Joachim Kuss für die Vorhersage von Gradienten nutzen. Auch die Softwaretools von Mike Hillebrand zum Abschätzen der Fehler bei der Integration könnten das Interesse der Leser geweckt haben. Schließlich kann die Linksammlung von Torsten Beyer „Gold“ wert sein und unnötiges Suchen ersparen. Wir möchten Ihnen die Möglichkeit geben, diese Tools online zu nutzen. WILEY-VCH stellt folgenden Link zur Verfügung: www.wiley-vch.de/textbooks. Dort finden Sie das Original-Makro von Hans-Joachim Kuss zur Vorhersage von Gradienten, je eine Demo-Version der zwei Integrationstools von Mike Hillebrand sowie die Linkliste von Thorsten Beyer, die stets aktualisiert wird.

Autorenverzeichnis

Erik Becker

Institut Kirchhoff GmbH

Albestr. 3–4

12159 Berlin

Deutschland

Torsten Beyer

Dr. Beyer Internet-Beratung

Weimarer Straße 30

64372 Ober-Ramstadt

Deutschland

Mike Hillebrand

Sanofi-Aventis Dtl. GmbH

Industriepark Höchst

65926 Frankfurt

Deutschland

Andreas Hofmann

Novartis Institutes for BioMedical Research

Novartis Campus

4056 Basel

Schweiz

Stavros Kromidas

Rosenstr. 16

66125 Saarbrücken

Deutschland

Hans-Joachim Kuss

Neubiberger Str. 54

85640 Putzbrunn

Deutschland

Stefan Lamotte

BASF SE

Competence Center Analytics,

GMC/C-E210

67056 Ludwigshafen

Deutschland

Jürgen Maier-Rosenkranz

Alltech Grom GmbH

Grace Materials Technologies

In der Hollerhecke 1

67547 Worms

Deutschland

Markus M. Martin

Thermo Fisher Scientific

Dornierstr. 4

82110 Germering

Deutschland

Alban Muller

Novartis Institutes for BioMedical Research

Novartis Campus

4056 Basel

Schweiz

Marco Nestola

Institut Kirchhoff GmbH

Albestr. 3–4

12159 Berlin

Deutschland

Iris Retzko

CMC Pharma GmbH

M5, 8–9

68161 Mannheim

Deutschland

Oliver Schmitz

University of Duisburg-Essen

Facult. of Chem. S05 T01 B35

Universitätsstr. 5

45141 Essen

Deutschland

Stefan Schmitz

CMC Pharma GmbH

M5, 8–9

68161 Mannheim

Deutschland

Arno Simon

beyontics GmbH

Altonaer Straße 79–81

13581 Berlin

Deutschland

Frank Steiner

Thermo Fisher Scientific

Dornierstr. 4

82110 Germering

Deutschland

1

LC/MS-Kopplung

Oliver Schmitz, Markus M. Martin, Alban Muller, Andreas Hofmann

1.1 Stand der Technik in der LC/MS-Kopplung

Oliver Schmitz

1.1.1 Einleitung

Die drastisch gestiegenen Anforderungen an qualitative und quantitative Analysen von immer komplexeren Proben stellen eine immense Herausforderung für die moderne instrumentelle Analytik dar. Für komplexe organische Proben (z. B. Körperflüssigkeiten, Naturprodukte oder Umweltproben) erfüllen nur chromatographische oder elektrophoretische Trennungen mit anschließender massenspektrometrischer Detektion diese Anforderungen. Aktuell ist jedoch ein Trend zu beobachten, bei dem eine komplexe Probenvorbereitung und Vortrennung durch hochauflösende Massenspektrometer mit Atmosphärendruck-Ionenquellen ersetzt werden.

Dabei sind jedoch zahlreiche Ionen-Molekül-Reaktionen in der Ionenquelle – vor allem bei komplexen Proben, aufgrund einer unvollständigen Trennung – möglich, weil die Ionisation in typischen Atmosphärendruck-Ionisationquellen unspezifisch ist [1]. Somit führt diese Vorgehensweise oft zu einer Ionensuppression und Artefaktbildung in der Ionenquelle, vor allem bei der Elektrospray-Ionisation (ESI) [2], siehe dazu auch Abschnitt 1.1.2.

Trotzdem können Quellen wie die ASAP (atmospheric-pressure solids-analysis probe), DART (direct analysis in real time) und DESI (desorption electrospray ionization) oft sinnvoll eingesetzt werden. In ASAP wird ein heißer Stickstofffluss aus einer ESI- oder „atmospheric pressure chemical ionization”(APCI)-Quelle als Energiequelle für die Verdampfung eingesetzt und die einzige Änderung gegenüber einer APCI-Quelle ist die Installation einer Einschubmöglichkeit, um die Probe in den heißen Gasstrom innerhalb der Ionenquelle zu platzieren [3]. Diese Ionenquelle ermöglicht eine schnelle Analyse von flüchtigen und schwerflüchtigen Verbindungen und wurde beispielsweise eingesetzt, um biologische Gewebe [3], Polymeradditive [3], Pilze und Zellen [4] und Steroide [3, 5] zu analysieren. ASAP hat viele Gemeinsamkeiten mit DART [6] und DESI [7]. Die DART-Ionenquelle erzeugt einen Gasstrom, der langlebige elektronisch angeregte Atomen enthält, die mit der Probe interagieren können und so eine Desorption mit anschließender Ionisation der Probe mittels Penning-Ionisation [8] oder Protonentransfer von protonierten Wasserclustern [6] induzieren. Die DART-Quelle wird für die direkte Analyse von festen und flüssigen Proben eingesetzt. Ein großer Vorteil dieser Quelle ist die Möglichkeit der Analyse von Verbindungen auf Oberflächen, wie z. B. illegale Substanzen auf Dollarnoten oder Fungizide auf Weizen [9]. Im Gegensatz zu ASAP und DART ist der große Vorteil von DESI, dass – wie bei der klassischen ESI – die Flüchtigkeit der Analyten keine Voraussetzung für eine erfolgreiche Analyse ist. DESI ist am empfindlichsten für polare und basische Verbindungen und weniger empfindlich für Analyten mit einer geringen Polarität [10]. Diese sehr nützlichen Ionenquellen haben einen gemeinsamen Nachteil. Alle oder fast alle in der Probe befindlichen Substanzen sind in der Gasphase und während der Ionisation zeitgleich in der Ionenquelle vorhanden. Die Analyse komplexer Proben kann daher zu einer Ionensuppression und Artefaktbildung in der Atmosphärendruck-Ionenquelle aufgrund von Ionen-Molekül-Reaktionen auf dem Weg zum MS-Einlass führen. Aus diesem Grund werden einige ASAP-Anwendungen mit steigender Temperatur des Stickstoffgases in der Literatur beschrieben [5, 11, 12]. Auch wurden DART-Analysen mit verschiedenen Heliumtemperaturen [13] oder mit einem Heliumtemperaturgradienten [14] beschrieben, um eine teilweise Trennung von Analyten aufgrund der unterschiedlichen Dampfdrücke der Analyten zu realisieren. Eine mit DART und ASAP verwandte und erst 2012 beschriebene Ionenquelle, die Direct-Inlet-Probe APCI (DIP-APCI) der Firma Scientific Instruments Manufacturer GmbH (SIM) nutzt eine temperierbare Schubstange zum Direkteinlass von festen und flüssigen Proben mit anschließender chemischer Ionisation bei Atmosphärendruck [15]. Abbildung 1.1 zeigt eine DIP-APCI-Analyse einer Safranprobe (Feststoff, Gewürz) ohne Probenvorbereitung mit den safranspezifischen Biomarkern Isophoron und Safranal. Als Detektor wurde ein Agilent Technologies 6538 UHD Accurate-Mass Q-TOF eingesetzt. Im oberen Teil der Abbildung ist der TIC der gesamten Analyse und im unteren Teil exemplarisch das Massenspektrum zum Zeitpunkt 2,7 min dargestellt. Die Analyse wurde bei 40 °C gestartet und die Probe mit 1 °/s auf eine finale Temperatur von 400 °C aufgeheizt.

So nützlich und zeitersparend diese Ionenquellen auch sein mögen, um komplexe Proben quantitativ und quantitativ analysieren zu können, ist eine chromatographische oder elektrophoretische Vortrennung sinnvoll. Neben der Reduzierung von Matrixeffekten ermöglicht der Vergleich der Retentionszeiten zudem noch eine Analyse von Isomeren (eine entsprechend leistungsstarke Trennung vorausgesetzt).

1.1.2 Ionisationsmethoden bei Atmosphärendruck-Massenspektrometern

In den letzten 10 Jahren wurden einige neue Ionisationsmethoden für Atmosphärendruck (AP)-Massenspektrometer entwickelt. Davon stehen manche nur in einigen Arbeitskreisen zur Verfügung, weshalb hier lediglich vier kommerziell erhältliche Ionenquellen näher vorgestellt werden sollen.

Abb. 1.1 Analyse von Safran mittels DIP-APCI und einem hochauflösenden qTOF-MS

Abb. 1.2 Geeigneter Polaritätsbereich von Analyten für die Ionisation mit verschiedenen APITechniken. Hinweis: Der erweiterte Massenbereich der APLI gegenüber APPI und APCI ergibt sich aus der Ionisation von unpolaren aromatischen Analyten in einem Elektrospray.

Die am weitesten verbreitete Atmosphärendruck-Ionisierungstechnik (API) ist ESI, gefolgt von APCI und Atmosphärendruck-Photoionisation (APPI). Eine deutlich geringere Bedeutung hat die „atmospheric pressure laser ionization“ (APLI), die allerdings für aromatische Verbindungen hervorragend geeignet ist und z. B. für die PAK-Analytik den Gold-Standard darstellt. Dieses Ranking spiegelt mehr oder weniger die chemischen Eigenschaften der Analyten, die mit API-MS bestimmt werden, wider: