HPLC richtig optimiert -  - E-Book

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Beschreibung

Neben der Methodenentwicklung ist die Optimierung bestehender Methoden eine zentrale Aufgabe im HPLC-Labor. Eine Aufgabe, die heute in immer kurzerer Zeit und kosteneffizient erledigt werden muss. Das Handbuch bietet eine fundierte Hilfe, um diese Herausforderung noch besser zu meistern.
International renommierte Autoren behandeln sowohl die allgemeinen Grundlagen und Strategien der Optimierung als auch die spezifischen Aspekte der unterschiedlichen Techniken wie RP-HPLC, NP-HPLC, Micro- und Nano-HPLC sowie der Kopplungstechniken wie LC-MS. Auch die richtige Saulenauswahl sowie Enantiomerentrennungen gehoren zu den behandelten Themen. Die Autoren liefern konkrete, praktische Tipps ebenso wie relevante Hintergrundinformationen. Sie bieten daruber hinaus Einblicke in die Optimierungspraxis sieben international renommierter Firmen verschiedener Branchen. Einige Beitrage stellen die Anwendung gangiger Optimierungssoftware wie DryLab oder ChromSword dar. Das ganze wird abgerundet durch praxisnahe Berichte erfahrener Anwender aus den verschiedenen Anwendungsgebieten, inbesondere aus den Life Sciences, wie beispielsweise Proteomics oder Pharmaentwicklung. Alle Beitrage sind in einem auf das Wesentliche konzentrierten und anwendungsnahen Stil geschrieben. Der Aufbau des Buches mit abgeschlossenen Kapiteln erleichtert das gezielte Nachschlagen.

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Seitenzahl: 906

Veröffentlichungsjahr: 2012

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Contents

Vorwort

Autorenverzeichnis

Zum Aufbau des Buches

1 Grundsätzliches zur Optimierung

1.1 Grundsätze der Optimierung in der HPLC am Beispiel der RP-Chromatographie

1.2 Schnelle Gradienten

1.3 Selektivitätsänderung in der RP-HPLC mithilfe des pH-Wertes

1.4 Auswahl des richtigen pH-Wertes in der HPLC

1.5 Optimierung der Auswertung in der Chromatographie

1.6 Gütekennwerte der Kalibration und Messunsicherheit als Indikatoren für Optimierungspotenzial

2 Die Charakteristika der Optimierung in einzelnen HPLC-Modi

2.1 RP-HPLC

2.2 Optimierung in der Normalphasen-Chromatographie

2.3 Optimierung von GPC-Analysen durch geeignete Wahl von stationärer Phase und Detektionsverfahren

2.4 Gelfiltration – Größenausschluss-Chromatographie von Biopolymeren –Optimierungsstrategien und Fehlersuche

2.5 Optimierung in der Affinitätschromatographie

2.6 Optimierung von Enantiomerentrennungen in der HPLC*

2.7 Miniaturisierung

3 Kopplungstechniken

3.1 Immunchromatographische Kopplungen

3.2 Erweiterte Charakterisierungs- und Analysemöglichkeiten durch 2-dimensionale Chromatographie

3.3 LC-MS – Hinweise zur Optimierung und Fehlersuche

3.4 LC-NMR-Kopplung

4 Computer-unterstützte Optimierung

4.1 Computer-unterstützte HPLC-Methodenentwicklung mit der DryLab®-Software

4.2 ChromSword®-Software für die automatische und Computerunterstützte HPLC-Methodenentwicklung

4.3 Multifaktorielle systematische Methodenentwicklung und -optimierung in der Umkehrphasen-HPLC

5 „Anwender berichten“

5.1 Nano-LC-MS/MS in der Proteomforschung

5.2 Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-HPLC

5.3 Trennung komplexer Proben

5.4 Evaluierung eines integrierten Verfahrens zur Charakterisierung von Chemikalienbibliotheken auf der Basis von HPLC-UV/MS/CLND

Anhang

Stichwortverzeichnis

Weitere interessante Titel zur HPLC

V. R. Meyer

Fallstricke und Fehlerquellen der HPLC in Bildern

2006

ISBN 3-527-31268-4

V. R. Meyer

Praxis der Hochleistungs-Flüssigchromatographie

2004

ISBN 3-527-30726-5

S. Kromidas

More Practical Problem Solving in HPLC

2004

ISBN 3-527-31113-0

J. Weiß

Ionenchromatographie

2001

ISBN 3-527-28702-7

S. Kromidas

Practical Problem Solving in HPLC

2000

ISBN 3-527-29842-8

Herausgeber

Dr. Stavros Kromidas

Rosenstraße 16

66125 Saarbrücken

Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung.

Bibliografische Information Der Deutschen Bibliothek

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über <http://dnb.ddb.de> abrufbar.

© 2006 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form – durch Photokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren – reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, dass diese von jedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind.

Print ISBN 9783527314706

Epdf ISBN 978-3-527-62353-2

Epub ISBN 978-3-527-66035-3

Mobi ISBN 978-3-527-66034-6

Vorwort

Das Optimieren von Verhaltensweisen und Prozessen stellt eine notwendige Voraussetzung für langfristigen Erfolg dar. Das Ziel und die Beweggründe können dabei recht unterschiedlich sein: Selbsterhaltung bei Lebewesen, „Leben retten“ beim Helfer in Afrika, Gewinnmaximierung beim Marketing-Strategen oder neue Erkenntnisse beim Wissenschaftler. Dieses Prinzip gilt natürlich auch in der Chemie und in der Analytik.

Das vorliegende Buch behandelt ausschließlich das Thema „Optimierung“ in der HPLC. Es wird versucht, diesen wichtigen Aspekt der HPLC auf vielfältige Art und Weise zu beleuchten. Zum einen haben wir uns mit grundsätzlichen Fragen und mit prinzipiellen Überlegungen und Hintergründen auseinander gesetzt. Im gleichen Maße haben wir uns bemüht, möglichst viele Praxisbeispiele, Anregungen und Vorschläge für den HPLC-Alltag vorzustellen und zu diskutieren. Die Ausführungen sollen beim Planen effektiver Strategien zur Methodenentwicklung ebenso unterstützen und helfen wie in der täglichen Praxis vor Ort, wenn es um Konzepte für eine schnelle Optimierung geht. Das Ziel des Buches ist, einen Beitrag für eine zweckgerichtete, bezahlbare Vorgehensweise bei Methodenentwicklung und Optimierung in der HPLC zu leisten.

Dazu haben international renommierte Fachleute ihr Wissen und ihre Erfahrungen zur Verfügung gestellt. Diesen Kollegen gilt mein herzlicher Dank. Dem Verlag WILEY-VCH und insbesondere Steffen Pauly danke ich für die sehr gute Zusammenarbeit und Kooperationsbereitschaft.

Saarbrücken, Januar 2006

Stavros Kromidas

Autorenverzeichnis

Klaus Albert

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Bonnie A. Alden

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Mario Arangio

CarboGen AG

Schachenallee 29

5001 Aarau

Schweiz

Wolf-Dieter Beinert

VWR International GmbH

Scientific Instruments

Hilpertstraße 20A

64295 Darmstadt

Roberto Biancardi

Solvay Solexis SpA

Viale Lombardia, 20

20021 Bollate (MI)

Italien

Hans Bilke

Sandoz GmbH

Biochemiestraße 10

6250 Kundl

Österreich

Yung-Fong Cheng

Cubist Pharmaceuticals

65 Hayden Ave.

Lexington, MA 02421

USA

Maristella Colombo

Oncology – Analytical Chemistry

Nerviano Medical Sciences

Viale le Pasteur, 10

20014 Nerviano (MI)

Italien

Diane M. Diehl

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

John W. Dolan

BASi Northwest Laboratory

3138 NE Rivergate

Building 301C

McMinnville, OR 97128

USA

Melvin R. Euerby

AstraZeneca R&D Charnwood

Analytical Development,

Pharmaceutical and Analytical R&D

Charnwood/Lund

Bakewell Road

Loughborough, Leicestershire,

LE11 5RH

United Kingdom

Sergey Galushko

Dr. S. Galushko Software

Entwicklung

Im Wiesengrund 49b

64367 Mühltal

Eric S. Grumbach

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Marc D. Grynbaum

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Heidi Händel

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Tom Hennessy

Biopolis

Biomedical Science Group

20 Biopolis way

Singapore 1 38668

Singapur

Pamela C. Iraneta

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Markus Juza

Chiral Technologies Europe

Parc d’Innovation

Boulevard Gonthier d’Andernach

BP 80140

67404 Illkirch Cedex

Frankreich

Marianna Kele

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Peter Kilz

PSS Polymer Standards Service

GmbH

Postfach 3368

55023 Mainz

Stavros Kromidas

Rosenstraße 16

66125 Saarbrücken

Manfred Krucker

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Hans-Joachim Kuss

Psychiatrische Klinik der

Ludwig-Maximilians-Universität

Nussbaumstraße 7

80336 München

Jörg P. Kutter

MIC – Department of Micro and

Nanotechnology

Technical University of Denmark

2800 Lyngby

Dänemark

Christiane Lohaus

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Ziling Lu

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Egidijus Machtejevas

Institut für Anorganische Chemie

und Analytische Chemie

Johannes Gutenberg-Universität

Duesbergweg 10–14

55099 Mainz

Jürgen Maier-Rosenkranz

GRACE Davison –

Alltech Grom GmbH

Discovery Sciences

Etzwiesenstraße 37

72108 Rottenburg-Hailfingen

Friedrich Mandel

Agilent Technologies

Hewlett-Packard-Straße 8

76337 Waldbronn

Katia Marcucci

Sienabiotech S.p.A.

Via Fiorentina, 1

53100 Siena

Italien

Katrin Marcus

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Jeffrey R. Mazzeo

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Michael McBrien

Advanced Chemistry Development, Inc.

110 Yonge Street, 14th Floor

Toronto, Ontario

Canada M5C 1T4

Alberto Méndez

Waters Cromatografia S.A.

Parc Tecnològic del Vallès

08290 Cerdanyola del Vallès

Barcelona

Spanien

Helmut E. Meyer

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Veronika R. Meyer

EMPA St. Gallen

Materials Science and Technology

Lerchenfeldstraße 5

9014 St. Gallen

Schweiz

Egbert Müller

Tosoh Bioscience GmbH

Zettachring 6

70567 Stuttgart

Uwe D. Neue

Waters Corporation, CRD

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Patrik Petersson

AstraZeneca R&D Lund

Analytical Development

Pharmaceutical and Analytical R&D

Charnwood/Lund

Lund 22187

Schweden

Michael Pfeffer

Schering AG

In-Process-Control

13342 Berlin

Karsten Putzbach

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Oleg Pylypchenko

Institute of Bioorganic Chemistry of

Ukrainian National Academy of

Sciences

Murmanskaja str., 1

02660 Kiev-94, MCP-600

Ukraine

Milena Quaglia

LGC

Analytical Technology

Queens Road

Teddington, Middlesex, TW11 OLY

United Kingdom

Giuseppe Razzano

Via D. Manin,18

Magenta (Cap. 20013)

Milano

Italien

Vincenzo Rizzo

CISI – University of Milan

Via Fantoli, 16/15

20138 Milano

Italien

Heike Schäfer

Medizinisches Proteom-Center

Zentrum für Klinische Forschung

Ruhr-Universität Bochum

Universitätsstraße 150

44780 Bochum

Stefan Schömer

pro-isomehr

Altenkesseler Straße 17

66115 Saarbrücken

Irina Shishkina

Institute of Bioorganic Chemistry of

Ukrainian National Academy of

Sciences

Murmanskaja str., 1

02660 Kiev-94, MCP-600

Ukraine

Dirk Sievers

Waters GmbH

Hauptstraße 87

65760 Eschborn

Federico R. Sirtori

Nerviano Medical Sciences

Oncology – Analytical Chemistry

Viale Pasteur 10

20014 Nerviano (MI)

Italien

Urban Skogsberg

Cambrex Karlskoga AB

R&D Analysis

69185 Karlskoga

Schweden

Lloyd R. Snyder

LC Resources Inc.

26 Silverwood Ct.

Orinda, CA 94563

USA

Frank Steiner

Dionex Softron GmbH

Dornierstraße 4

82110 Germering

Cinzia Stella

Imperial College

Biological Chemistry Department

Biomedical Sciences Division

Sir Alexander Fleming Building

London, SW7 2AZ

United Kingdom

Vsevolod Tanchuk

Institute of Bioorganic Chemistry of

Ukrainian National Academy of

Sciences

Murmanskaja str., 1

02660 Kiev-94, MCP-600

Ukraine

KimVan Tran

Waters Corporation, CAT

34 Maple Street

Milford, MA 01757

USA

Klaus K. Unger

Institut für Anorganische Chemie

und Analytische Chemie

Johannes Gutenberg-Universität

Duesbergweg 10–14

55099 Mainz

Jean-Luc Veuthey

Faculty of Sciences

School of Pharmaceutical Sciences

University of Geneva

20, Bd d’Yvoy

1211 Genève 4

Schweiz

Knut Wagner

Pharma Analytical Laboratory

Merck KGaA

Frankfurter Straße 250

64293 Darmstadt

Michael G. Weller

Institut für Wasserchemie und

Chemische Balneologie

Technische Universität München

Marchioninistraße 17

81377 München

Norbert Welsch

Institut für Organische Chemie

Universität Tübingen

Auf der Morgenstelle 18

72076 Tübingen

Loren Wrisley

Analytical and Quality Sciences

Wyeth Research

401 N. Middletown Road

Pearl River, NY 10965

USA

Zum Aufbau des Buches

Das Buch besteht aus fünf Teilen.

Teil 1: Grundsätzliches zur Optimierung in der HPLC

Im Teil 1 wird versucht, wichtige Aspekte der Optimierung in der HPLC aus verschiedenen Blickwinkeln zu beleuchten. Im ersten Kapitel (1.1 Stavros Kromidas) werden die Grundsätze der Optimierung am Beispiel der RP-HPLC dargestellt und Vorschläge zur Methodenentwicklung gemacht. Schnelle Gradienten an kurzen Säulen führen häufiger als man zunächst annehmen würde zu ausreichender Auflösung bei kürzesten Analysenzeiten, diese Thematik wird in Kapitel 1.2 diskutiert (Uwe D. Neue). Der pH-Wert ist bei der Trennung von polaren/ionischen Substanzen mit Abstand der wichtigste Faktor im Optimierungsgeschehen. Diesem Aspekt sind die zwei nachfolgenden Kapitel gewidmet (1.3 Uwe D. Neue, 1.4 Michael McBrien). Optimierung bedeutet mehr als lediglich die „richtige“ Wahl von Methodenparametern. Zur Optimierung gehören alle Bemühungen, möglichst die maximale – oder vielleicht die notwendige – Information zu gewinnen. So kommen der Auswertung von chromatographischen Daten und der Kalibrierung eine gewichtige Bedeutung zu. Diese Themen werden in Kapitel 1.5 (Hans-Joachim Kuss) und 1.6 (Stefan Schömer) behandelt.

Teil 2: Die Charakteristika der Optimierung in einzelnen HPLC-Modi

Im Teil 2 wird auf die Spezifika der Optimierung in einzelnen Techniken eingegangen. In der RP-Chromatographie (Abschnitt 2.1) stellt neben der Auswahl des Eluenten (s. dazu auch Kapitel 1.1 bis 1.4) vor allem die Säulenauswahl eine schwierige und zeitraubende Aufgabe dar. Das Thema „RP-Säule“ wird von insgesamt sechs Autoren bearbeitet: Zwei Autoren (2.1.1 Stavros Kromidas, 2.1.2 Uwe D. Neue) gehen eher praktisch an diese Aufgabenstellung heran, während Frank Steiner (2.1.5) und Lloyd R. Snyder (2.1.6) zur Frage „Säulencharakterisierung“ und „Säulenauswahl“ grundsätzliche, theoretische Überlegungen – jedoch mit konkreter, praktischer Relevanz – vorstellen. Mit der Anzahl von experimentellen Daten nimmt naturgemäß die Aussagekraft zu, wobei das Handling der Zahlen und vor allem das Finden und Deuten von Korrelationen nur mit mathematischen Tools möglich ist. Chemometrie ist ein geeignetes Tool, um beispielsweise die Ähnlichkeit von Säulen anhand chromatographischer Daten herauszufinden. Die Anwendung der Chemometrie aus praktischer Sicht wird kurz in Kapitel 2.1.1 (Stavros Kromidas) und ausführlich in Kapitel 2.1.3 (Melvin R. Euerby) und 2.1.4 (Cinzia Stella) dargestellt. Zum Abschluss des Abschnittes „RP-HPLC“ zeigt Urban Skogsberg (2.1.7), wie durch Magic-Angle-Spinning-NMR-Spektroskopie genaue Informationen über die Wechselwirkungen und die Anordnung von funktionellen Gruppen an RP-Oberflächen erhalten werden können. Anschließend geht es um die Optimierung, aber auch um die Fehlersuche und die Fehlervermeidung in folgenden Bereichen der HPLC: Normal Phase (2.2 Veronika R. Meyer), GPC (2.3 Peter Kilz), Gelfiltration (2.4 Klaus K. Unger), Affinitätschromatographie (2.5 Egbert Müller) und Enantiomerentrennung (2.6 Markus Juza). Drei unterschiedliche Ansätze wurden gewählt, um sich mit dem Thema Miniaturisierung auseinander zu setzen: Jürgen Maier-Rosenkranz beschäftigt sich in Kapitel 2.7.1 mit der Micro/Nano-LC, in Kapitel 2.7.2 stellt Jörg P. Kutter Flüssig(chromatographische)-Trennungen auf Chips vor und in Kapitel 2.7.3 beschreibt Uwe D. Neue die Möglichkeiten und Grenzen einer neuen Variante der klassischen HPLC, der UPLC. Mit allen drei Techniken ist eine bemerkenswerte Zeitersparnis möglich – es werden allerdings auch Limitierungen und Schwierigkeiten genannt.

Teil 3: Kopplungstechniken

Teil 3 ist ausschließlich den Kopplungen vorbehalten. Je anspruchsvoller die analytische Fragestellung in der Separationstechnik ist (Komplexität und Anzahl der Probenkomponenten, große chemische Ähnlichkeit der zu trennenden Analyte usw.), umso notwendiger erscheinen Kopplungstechniken. Dabei führen zum einen Kopplungen zwischen verschiedenen Trenntechniken zu einer Verbesserung der chromatographischen Auflösung wie z. B. Immunochromatographie (3.1 Michael G. Weller) und LC-GPC-Kopplung (3.2 Peter Kilz). Zum anderen führt bei einer gegebenen Auflösung die Kopplung LC-Spektroskopie zu einer spezifisch(er)en Aussage. Die populärsten Kopplungstechniken sind LC-MS (3.3 Friedrich Mandel) und LC-NMR (3.4 Klaus Albert).

Teil 4: Computer-unterstützte Optimierung

Automatisierung kann generell zur Fehlervermeidung und Zeitersparnis führen. Die vollautomatische bzw. halbautomatische, Computer-unterstützte Methodenentwicklung und Optimierung in der HPLC hat in der Zwischenzeit einen beachtlichen Reifegrad erreicht. Anhand mehrerer realer Beispiele legt Lloyd R. Snyder (4.1) die Möglichkeiten der DryLab- und Sergey Galushko (4.2) die der ChromSword-Software dar. Michael Pfeffer (4.3) vergleicht die zwei Software- Konzepte aus Anwendersicht und präsentiert ein neues Software-Tool, in dem auch die automatische Säulenauswahl integriert ist.

Teil 5: „Anwender berichten“

Im letzten Teil kommen Anwender zu Wort. In vier unterschiedlichen Fällen werden zwar anspruchsvolle und/oder neue Techniken/Konzepte zur Lösung einer bestimmten Fragestellung vorgestellt – diese jedoch eben aus Anwendersicht und praxisnah. Der eine oder andere Lösungsansatz könnte für manche(n)

Leser(in) eventuell interessant sein. Katrin Marcus (5.1) stellt die Praxis der LCMS/MS-Kopplung in der Proteomforschung vor, Hans Bilke (5.2) zeigt Wege zur Überprüfung der Robustheit in der RP-LC auf, Knut Wagner (5.3) beschreibt eine Hardware-Lösung zur Trennung komplexer Gemische und Mario Arangio (5.4) geht auf die Möglichkeit der Multidetektion (UV, MS, CLND) zur Charakterisierung neu synthetisierter Substanzen ein.

Die fünf Teile stellen thematische Einheiten dar, dennoch muss das Buch nicht unbedingt linear gelesen werden. Dazu wurden die einzelnen Kapitel so verfasst, dass sie abgeschlossene Module darstellen, ein „Springen“ ist jederzeit möglich. Damit haben wir versucht, dem Charakter des Buches als Nachschlagwerk gerecht zu werden. Unterschiedliche Auffassungen der Autoren zu einem Thema wurden akzeptiert, auch wurde manche Wiederholung in Kauf genommen, um die Harmonie im textlichen Kontext nicht zu beeinträchtigen. Schließlich werden einige wichtige Inhalte von mehreren Autoren behandelt, die naturgemäß unterschiedliche Akzente setzen. So beispielsweise „pH-Wert“ (Uwe D. Neue, Michael McBrien), „gewichtete Regression“ (Hans-Joachim Kuss, Stefan Schömer), „Selektivität von stationären RP-Phasen“ (Stavros Kromidas, Uwe D. Neue, Melvin R. Euerby, Cinzia Stella, Lloyd R. Snyder), „Chemometrie“ (Stavros Kromidas, Melvin R. Euerby, Cinzia Stella) oder „LC-MS“ (Friedrich Mandel, Katrin Marcus). Der Leser möge von der unterschiedlichen Darstellung des Themas und von der individuellen Gewichtung der Autoren profitieren.

1

Grundsätzliches zur Optimierung

1.1 Grundsätze der Optimierung in der HPLC am Beispiel der RP-Chromatographie

Stavros Kromidas

Zunächst werden einige Fragen diskutiert, die sinnvollerweise zu Beginn einer Methodenentwicklung zu klären sind. Anschließend wenden wir uns den prinzipiellen Möglichkeiten zur Verbesserung der Auflösung in der HPLC zu. Es folgt eine Diskussion über Effizienz und Abfolge der einzelnen Maßnahmen für den isokratischen und den Gradienten-Modus. Ein Schwerpunktthema der Ausführungen bilden Strategien und Konzepte zur Methodenentwicklung und Überprüfung der Peakhomogenität. Schließlich werden Wege zur Verfolgung weiterer Ziele als „besser trennen“ aufgezeigt: „schneller trennen“, „empfindlicher messen“, „Geld sparen“. Das Kapitel wird mit einer Zusammenfassung und einem Ausblick beendet.

1.1.1 Vor den ersten Optimierungsschritten

Es ist aus Gründen der Ökonomie sinnvoll, sich zu Beginn einer Methodenentwicklung/Trennungsoptimierung als erste Aktion mit folgenden Fragen zu befassen:

Was will ich?

Also: Was ist das eigentliche Ziel meiner Trennung?

Was habe ich?

Also: Über welche analytisch relevante Informationen bzgl. der Probe verfüge ich?

Wie mache ich

es? Also: Steht das, was ich bräuchte, zur Verfügung und ist das, was ich vorhabe, auch tatsächlich realisierbar?

Auch wenn auf den ersten Blick diese Fragen etwas (zu) theoretisch oder gar abgehoben erscheinen mögen, halte ich es für notwendig, zu Beginn eines Projekts die analytische Fragestellung und die realistischen Möglichkeiten zu deren Bewältigung bewusst wahrzunehmen. Ein frühes Gespräch mit meinem Chef, meinem Kollegen, meinem Kunden oder zur Not mit mir selbst kann späteren Ärger, Zeitvergeudung und letztendlich Kosten ersparen. Diese Zeit kann als eine sichere Investition angesehen werden.

Zur ersten Frage: Was will ich?

Wenn irgend möglich, sollten vor dem Start folgende oder ähnliche Fragen beantwortet werden:

Brauche ich eine Methode, um

diesen

hochtoxischen Metaboliten auf jeden Fall zu quantifizieren, oder verfolge ich das Ziel, dass die Behörde meine Methode akzeptiert?

Was ist im vorliegenden Fall wichtig: Schnelle Analysenzeiten, langlebige Säulen, robuste Bedingungen, oder steht im Vordergrund eine höchstmögliche Spezifität ohne Wenn und Aber?

Warum darf der

VK

(

VK:

Variationskoeffizient) höchstens 2 % betragen? Um wie viel schlechter wird unser Produkt, wenn sich ein

VK

von 2,5 % ergeben würde? Gehen die Analysenkosten tatsächlich mit der Qualität des Produkts einher?

Es handelt sich, vereinfacht formuliert, um folgende Frage: Geht es im konkreten Fall um die Erfüllung von Anforderungen, oder geht es tatsächlich um „Wahrheit“, d. h., stehen formale Aspekte oder die analytische Fragestellung im Vordergrund? Diese Frage sollte wegen möglicher Konsequenzen bewusst und ehrlich beantwortet werden. Wie schwer es in unserer Zeit ist, zu sinnvollen und durchdachten Entscheidungen zu stehen, ohne als Exot oder gar als Querulant zu gelten, wurde an anderer Stelle beschrieben [1].

Wenn (!) das Umfeld es ermöglicht, sollte man sich darin üben, alles zu hinterfragen. Unkonventionelle Fragen führen häufig zu einfachen, vernünftigen Lösungswegen.

Zur zweiten Frage: Was habe ich?

Informationen über die Probe erleichtern die Entwicklung eines geeigneten Methodendesigns, z. B.:

Was steht im Bericht der Kollegen aus der chemischen Entwicklung über Lichtempfindlichkeit und Sorptionsverhalten des neuen Wirkstoffs gegenüber Glasoberflächen? Kann ich schnell dort anrufen? Das heißt, komme ich mit einem vertretbaren Aufwand an relevante Informationen heran?

Stehen in der internen Datenbank (die bedauerlicherweise selten gepflegt und noch seltener in Anspruch genommen wird) nicht doch Informationen über ähnliche Trennungen aus der Vergangenheit, die seinerzeit nicht weiterverfolgt wurden?

Ich kann doch schnell über die bekannte Struktur der Hauptkomponente ihren p

K

s

-Wert ausrechnen und so beim geeigneten pH-Wert die ersten Versuche starten (s. Kap. 1.4). Die entsprechende Software hatten wir doch vor kurzem gekauft, oder wie war es? Wie sind die Erfahrungen des Kollegen Miller aus der Nachbarabteilung, der früher mit ähnlichen Substanzen zu tun hatte?

Wenn die Widerstände nicht allzu groß sind, sollte man das Mittel der Kommunikation und des Austauschs nutzen – wenn es sein muss, ohne darüber zu sprechen.

Zur dritten Frage: Wie mache ich es?

Man sollte die Machbarkeit eines Vorhabens unbedingt realistisch abschätzen, mögen sonstige Fakten und Argumente objektiv auch noch so „richtig“ sein, z. B.:

Kann ich meinen Abteilungsleiter davon überzeugen, dass es aus Gesamt-Firmensicht sinnvoll wäre, im Vorfeld (!) mit den späteren Routineanwendern über Methodendesign und weitere Details der Methode zu sprechen? Wenn allerdings Angst um Know-How-Verlust oder Budgetfragen oder sonstige psychosoziale Barrieren ein Gespräch mit den „anderen“ de facto unmöglich machen, ist dies eine bittere, aber eine zu akzeptierende Realität. Oder: Ist es sinnvoll, um eine Änderung folgender allgemein bekannter und akzeptierter Situation zu kämpfen?: Ein Termin ist vorgegeben, also ist die Validierung in zwei Wochen durchzuziehen. Die späteren (immensen) Folgekosten durch Wiederholmessungen, Reklamationen usw., die unweigerlich dadurch entstehen, dass kaum eine analytische Methode unter realen Bedingungen in zwei Wochen zu validieren ist, belasten ja nicht „uns“, sondern die Qualitätskontrolle. Als Prüfkosten gehen sie unter und werden mangels nüchterner, ganzheitlicher Betrachtung sowieso seit Jahrzehnten in Kauf genommen. Die Konsequenzen, oder positiv formuliert, das Verbesserungspotenzial möge der Leser sich selbst ausmalen.

Lesen Sie weiter in der vollständigen Ausgabe!

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