Risk Assessment of Phytochemicals in Food E-Book

• Herausgeber: Wiley-VCH
• Kategorie: Fachliteratur
• Serie: Forschungsberichte (DFG)
• Sprache: Englisch

Seitenzahl: 797

Veröffentlichungsjahr: 2011

Beschreibung

Providing the scientific background on the risk and safety assessment of toxicity in phytochemicals in everyday food, this monograph contains the pros and cons of 20 testing methods, with comments by the internationally acknowledged and independent DFG Senate Commission on Food Safety.
Supplemented by 40 poster contributions on phytochemicals and their effects.

Leseprobe

Contents

Copyright

Vorwort

Preface

1 Bericht und Schlussfolgerungen

1.1 Einleitung

1.2 Methodenübergreifende Aspekte

1.3 Methoden

1.4 Schlussfolgerungen und Empfehlungen

1.5 Fazit

2 Report and Conclusions

2.1 Preface

2.2 Transdisciplinary Aspects

2.3 Methodologies

2.4 Conclusions and Recommendations

2.5 Concluding Remarks

3 Contributions

3.1.1 Introduction

3.1.2 A New Vision of Toxicity Testing

3.1.3 Testing the Vision

3.1.4 Steps toward a New Toxicology

3.1.5 The Precautionary Principle

3.1.6 The European Side

3.1.7 Tasks Ahead

Acknowledgements

Abbreviations and Glossary of Terms

References

3.2 Safety Assessment of Botanicals and Botanical Preparations Used as Ingredients in Food Supplements: Testing an European Food Safety AuthorityTiered Approach

3.2.1 Introduction

3.2.2 Materials and Methods

3.2.3 Results

3.2.4 Discussion

Acknowledgement

References

3.3 In Silico Toxicology Screening of the Rodent Carcinogenic Potential of Phytochemicals Using Quantitative Structure–Activity Relationship Analysis

3.3.1 Introduction

3.3.2 Why Use In Silico Predictive Models at FDA?

3.3.3 What In Silico Predictive Models does the FDA Use?

3.3.4 What In Silico Predictive Software does the FDA Use?

3.3.5 Why Use In Silico Strategies as a Novel Approach to Assess Toxicity of Phytochemicals?

3.3.6 Prediction of Rodent Carcinogenicity of Phytochemicals in an External Validation Study

3.3.7 Conclusions

Acknowledgements

Conflict of Interest Statement

References

3.4 Testing Computational Toxicology Models with Phytochemicals

3.4.1 Introduction

3.4.2 Materials and Methods

3.4.3 Results

3.4.4 Discussion

Acknowledgements

Abbreviations

Conflict of Interest Statement

References

3.5 In Silico Models to Establish Level of Safety Concern in Absence of Sufficient Toxicological Data

3.5.1 Introduction

3.5.2 Computational Toxicology Models Relevant for the Food Sectors: Requirements

3.5.3 Available Computational Toxicology Models for Food Applications

3.5.4 Model Integration and Application

3.5.5 Computational Toxicology and Safety Assessment of Botanical Extracts

3.5.6 Discussion and Conclusion

References

3.6 In Silico Methods for Physiologically Based Biokinetic (PBBK) Models Describing Bioactivation and Detoxification of Coumarin and Estragole: Implications for Risk Assessment

3.6.1 Introduction

3.6.2 Methods

3.6.3 Results

3.6.4 Discussion

Acknowledgements

Abbreviations

Conflict of Interest Statement

References

3.7 In Vitro Models for Carcinogenicity Testing Reality or Fantasy?

3.7.1 Introduction

3.7.2 BALB/c 3T3 Cell Transformation Assay

3.7.3 Automated Soft Agar Assay

3.7.4 Concluding Remarks

Acknowledgments

References

3.8 Carcinogen Specific Expression Profiling: Prediction of Carcinogenic Potential?

3.9 Safety and Biological Efficacy Testing of Phytochemicals: An Industry Approach

3.9.1 Introduction

3.9.2 Screening Process

3.9.3 Regulatory Pre-Clinical Safety

3.9.4 Overall Conclusion

References

3.10 Metabolite Profiling in Rat Plasma as a Potential New Tool for the Assessment of Chemically Induced Toxicity

3.10.1 Introduction

3.10.2 Materials and Methods

3.10.3 Results and Discussion

3.10.4 Concluding Remarks

Acknowledgements

References

3.11 Profiling Techniques in Nutrition and Food Research

Hannelore Daniel1

3.11.1 Introduction

3.11.2 Genomics Applications in Basic and Pre-Clinical Nutrition and Food Research

3.11.3 Profiling Technologies Applied in Human Studies

3.11.4 Evidence for a Significant Role of the Gut Microbiota in Human Responses to Dietary Interventions

3.11.5 Summary

References

3.12 The Complex Links between Dietary Phytochemicals and Human Health Deciphered by Metabolomics

3.12.1 Introduction

3.12.2 Measuring Dietary Intake of Phytochemicals: Current Limitations

3.12.3 Biomarkers of Phytochemical Intake

3.12.4 Metabolomics and Biomarker Discovery

3.12.5 Metabolomics and Phytochemical Intake

3.12.6 Metabolomics and Biological Effects of Phytochemicals

3.12.7 Conclusion

Acknowledgments

Glossary4

Conflict of Interest Statement

References

3.13 Anti-Oxidative and Antigenotoxic Properties of Vegetables and Dietary Phytochemicals: The Value of Genomics Biomarkers in Molecular Epidemiology

3.13.1 Introduction

3.13.2 Colorectal Cancer Risk Prevention by Vegetables

3.13.3 Gene Expression Modulation in the Colon by Vegetables and Phytochemicals

3.13.4 Genetic Polymorphisms and Anti-Oxidative Response

3.13.5 Risk-Benefit Analysis of Dietary Phytochemicals

3.13.6 Concluding Remarks

References

3.14 The Japanese Toxicogenomics Project: Application of Toxicogenomics – Utilizing Toxicogenomics into Drug Safety Screening

3.14.1 Introduction

3.14.2 Current Status of Worldwide Toxicogenomics Database Creation

3.14.3 The Toxicogenomics Project in Japan

3.14.4 Application of Toxicogenomics

3.14.5 Future Perspectives

Acknowledgements

Conflict of Interest Statement

References

3.15 Toxicology and Risk Assessment of Coumarin: Focus on Human Data

3.15.1 Introduction

3.15.2 Hazard of Coumarin

3.15.3 Human Exposure

3.15.4 Risk Assessment

3.15.5 Summary and Conclusion

Abbreviations

Conflict of Interest Statement

References

3.16 Risk from Furocoumarins in Food? An Exposure Assessment

3.16.1 Introduction

3.16.2 Materials and Methods

3.16.3 Results and Discussion

3.16.4 Conclusions

Acknowledgements

References

3.17 Transcriptome Analysis in Benefit-Risk Assessment of Micronutrients and Bioactive Food Components

3.17.1 Introduction

3.17.2 Whole Genome Transcriptome Analysis as a Tool for Benefit-Risk Analysis

3.17.3 Data Confirmation by qRT-PCR

3.17.4 Magnitude of Micronutrient Effects

3.17.5 Data Interpretation

3.17.6 In Vivo and In Vitro Approaches

3.17.7 Animal Models and Diets

3.17.8 Sensitivity and Power

3.17.9 Conclusion

Acknowledgements

Conflict of Interest Statement

References

3.18 Colorectal and Prostate Cancer: The Role of Candidate Genes in Nutritional Pathways

3.18.1 Selenium: Biologic Mechanisms of the Chemopreventive Effects of Selenium

3.18.3 Overall Evidence from Candidate-Gene Association Studies for Cancer

References

3.19 Glucosinolates: DNA Adduct Formation In Vivo and Mutagenicity In Vitro

3.19.1 Introduction

3.19.2 Formation of DNA-Reactive Molecules in Plant Homogenates

3.19.3 Formation of DNA Adducts in Animals Fed with Broccoli

3.19.4 Elucidation of the Structure of Broccoli-Associated DNA Adducts and Identification of the Substances Involved

3.19.5 Mutagenicity of GLS-A

3.19.6 Conclusions and Perspectives

Acknowledgements

References

3.20 Defence Mechanisms against Toxic Phytochemicals in the Diet of Domestic Animals

3.20.1 Introduction

3.20.2 Polygastric Herbivory: Pre-Systemic Detoxification of Phytochemicals by the Rumen Microbiota

3.20.3 Monogastric Herbivory: Are Acquired Feeding Strategies Sufficiently Protective?

3.20.4 Efflux Transporters: Functional Elements of the Intestinal Barrier

3.20.5 Pre-Systemic Elimination by Biotransformation

3.20.6 Transcriptional Regulation of Efflux Transporters and Biotransformation Enzymes

3.20.7 Carnivorous Species: When Plant Metabolites Become Lethal

3.20.8 Risk Assessment of Phytochemicals in Animal Feeds

References

4 Posters

References

4.2 Coffee and Coffee Compounds are Effective Antioxidants in Human Cells and In Vivo

4.2.1 Introduction

4.2.2 Materials and Methods

4.2.3 Results and Discussion

Acknowledgments

References

4.3 Studying Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion of a Complex Extract

4.4 Polyphenolic Apple Extracts and their Constituents Modulate DNA Strand Breaks and Oxidation Damage in Human Colon Carcinoma Cells

4.4.1 Introduction

4.4.2 Methods

4.4.3 Results and Discussion

4.4.4 Conclusion

Acknowledgements

References

4.5 Comparative Evaluation of Experimental Data on α-Amylase Inhibition by Flavonoids Using Molecular Modelling

4.6 Potential Risk of Furan in Foods

4.7 Comparative Study on the Toxicity of Alternariol and Alternariol Monomethyl Ether in Human Tumour Cells of Different Origin

References

4.8 A Role for Resveratrol and Curcumine in Sensitization of Glioblastoma Cells to Genotoxic Stress Induced by Alkylating Chemotherapeutics

4.9 BfR Risk Assessment of Alkaloids as Ingredients and Contaminants of Food: Quinine, Opium Alkaloids, and Senecio Pyrrolizidine Alkaloids

4.9.1 Quinine in Bitter Soft Drinks – Are there Special Risk Groups?

4.9.2 Opium Alkaloids as Contaminants of Poppy Seeds

4.9.3 Senecio vulgaris L. as Contaminant of Mixed Salad

References

4.10 Elucidation of the Genotoxic Activity of the Alkaloid Ellipticine in Human Cell Lines

Conclusions

References

4.11 Dietary Supplements and Herbal MedicinalProducts – for a Clear Differentiation.Statement of the Society for Phytotherapy (GPT) to the “Article 13 Health Claim List” of the EFSA

4.11.1 Introduction

4.11.2 Conclusion

References

4.12 Assessment of Genotoxicity of Herbal Medicinal Preparations According to the Guideline EMEA/HMPC/107079/2007 – A Model Project of Kooperation Phytopharmaka, Bonn, Germany

4.12.1 The Genotoxicity Guideline of HMPC

4.12.2 Scope of the Project

4.12.3 Material and Methods

4.12.4 Results

Conclusions

References

4.13 Implications for an Adverse Effect of Vitamin C in Photodynamic Therapy

4.14 Using the Nematode Caenorhabditis elegans to Identify Mode of Action of the Flavonoid Myricetin

4.15 Low-Temperature Plasma - Mild Preservation Technology for Minimal Processed Fresh Food?

References

4.16 Influence of Fumonisin B1 on Gene Expression and Cytokine Production

4.17 Effects of Quercetin on the Detoxification of the Food Contaminant Benzo[a]pyrene in the Human Intestinal Caco-2 Cell Model

4.17.1 Introduction

4.17.2 Methods

4.17.3 Results and Discussion

4.17.4 Conclusions

Acknowledgments

References

4.18 Risk Assessment of T-2 and HT-2 Toxin Using Human Cells in Primary Culture

4.19 Pyrrolizidine Alkaloids in Honey Bee Products

4.19.1 Introduction

4.19.2 Method

4.19.3 Results and Discussion

4.19.4 Conclusion

Acknowledgments

References

4.20 Identification of Molecular Determinants for Cytotoxicity of Isoliquiritigenin from Liquorice (Glycyrrhiza glabra) towards Leukemia Cell Lines

References

4.21 Functional Effects of Polyphenol Metabolites Produced by Colonic Microbiota in Colon Cells In Vitro

4.21.1 Introduction

4.21.2 Methods

4.21.3 Results

4.21.4 Conclusion

4.22 Lifelong Exposure to Isoflavones Results in a Reduced Responsivity of the Mammary Gland in Female Rats towards Oestradiol

4.23 Derivation of Maximum Amounts for the Addition of Functional Ingredients to Foods

4.24 Constituents of Ginger Induce Micronuclei in Two Mammalian Cell Systems In Vitro

4.25 Relative Photomutagenic Potency of Furocoumarins and Limettin

4.26 Degradation of Green Tea Catechins

4.27 Evaluation of the Cytotoxic Effects of Herbal Homeopathic Extracts in Primary Human Hepatocytes In Vitro

4.27.1 Introduction

4.27.2 Materials and Methods

4.27.3 Data Analysis and Acceptance Criteria

4.27.4 Results

4.27.5 Discussion

4.27.6 Conclusion

Acknowledgments

References

4.28 Modulation of Antioxidant Gene Expression by Apple Juice in Rats

4.28.1 Introduction

4.28.2 Methods

4.28.3 Results and Discussion

4.28.4 Conclusion

Acknowledgments

References

4.29 Predictivity Comparison between Screening Assays for Bacterial Mutagenicity for Natural Compounds: Micro-Ames vs. Ames Fluctuation Method

4.30 Automated In Vitro Micronucleus Testing of Natural Compounds in Correlation with Hydrogen Peroxide

4.31 Permeability of Apple Polyphenols in T84 Cell Model and their Influence on Tight Junctions

4.32 Influence of Apple Polyphenols on Inflammatory Gene Expression

4.33 Diethylstilbestrol-Like Effects of Genistein on Gene Expression of Wnt-Signalling Components in the Endometrial Ishikawa Cell Line

4.33.1 Introduction

4.33.2 Methods

4.33.4 Conclusion

Acknowledgements

References

4.34 Effect of Dietary Flavonoids in Different Cell Lines: Comparison of Uptake, Modulation of Oxidative Stress and Cytotoxic Effects

4.35 Risk–Benefit Considerations of Isoflavone Supplements in the Treatment of Menopausal Vasomotor Symptoms

4.36 Effect of Different Catechins on the Growth of HT-29 Cells

4.36.1 Background

4.36.2 Aim

4.36.3 Methods

4.36.4 Results

References

4.37 Determination of the Isoflavone Content of SoyBased Infant Formula of the German Market Using a Box-Behnken Experimental Design for Optimizing the Analytical Conditions

4.37.1 Background

4.37.2 Aim

4.37.3 Method

4.37.4 Results

4.37.5 Discussion

4.37.6 Summary

Appendix

Deutsche Forschungsgemeinschaft

German Research Foundation

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Vorwort

Das Symposium „Risk Assessment of Phytochemicals in Food - Novel Approaches“der Senatskommission zur gesundheitlichen Bewertung von Lebensmitteln (SKLM) der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) wurde vom 30. März bis 01. April 2009 in Kaiserslautern abgehalten. Die Senatskommission hat dabei mit international anerkannten Experten aus Akademie, Industrie und Behörden die Perspektiven innovativer “OMICS”-Techniken unter Einbezug verschiedener in-silico-, in-vitro- und in-vivo-Verfahren diskutiert. Diese neuen Techniken befinden sich in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung und ihre Anwendbarkeit auf die Sicherheitsbewertung von Lebensmitteln ist derzeit noch offen. Die SKLM hat im Sinne ihres Beratungsauftrags für die DFG Schlussfolgerungen und Empfehlungen zum Forschungsbedarf erarbeitet, die gemeinsam mit den Einzelbeiträgen der Redner und den Posterbeiträgen in diesem Symposiums-Band veröffentlicht werden.

Die SKLM dankt der DFG für die nachhaltige Unterstützung der Symposienreihe. Diese Symposien bieten ein exzellentes Forum zur Beratung aktueller Themen von besonderer wissenschaftlicher Bedeutung mit besonders ausgewiesenen Wissenschaftlern. Ich danke den Teilnehmern des Symposiums für ihre wissenschaftlichen Beiträge und den Mitgliedern und Gästen der Senatskommission für ihre Mithilfe bei der Abfassung der vorliegenden Veröffentlichung. Ebenso danke ich den Mitgliedern des Redaktionskomitees sowie den Vorsitzenden und Rapporteuren des Symposiums, Prof. Hengstler, Prof. Joost, Prof. Kulling, Prof. Rietjens, Prof. Schlatter, Prof. Steinberg und Prof. Marko für ihre Mitarbeit bei der Formulierung der Schlussfolgerungen und Empfehlungen. Das wissenschaftliche Sekretariat der SKLM mit Dr. Sabine Guth, Dr. Michael Habermeyer und Dr. Barbara Kochte-Clemens hat wesentlich zum Zustandekommen dieses Bandes beigetragen. Ihnen gilt mein herzlicher Dank. Besonders danke ich der Leiterin des Fachreferates Lebenswissenschaften I der DFG, Frau Dr. Heike Strelen, für ihre engagierte Unterstützung der Arbeit der SKLM. Die SKLM gibt der Hoffnung Ausdruck, dass dieser aktuelle Bericht mit Symposiumsbeiträgen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen im forschungs- und gesundheitspolitischen Raum Beachtung findet.

Prof. Dr. Gerhard Eisenbrand

Vorsitzender der DFG-Senatskommission zur Bewertung der gesundheitlichen Unbedenklichkeit von Lebensmitteln

Preface

The Symposium “Risk Assessment of Phytochemicals in Food – Novel Approaches”, organized by the Senate Commission on Food Safety (SKLM) of the German Research Foundation (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG), was held from March 30th to April 1st 2009 in Kaiserslautern, Germany. The SKLM discussed with international experts from academia, industry and authorities the promise of innovative “OMICS” methodologies including various in silico, in vitro and in vivo approaches. These new methodologies are at different stages of development and their applicability for food safety assessment at present is still open. The SKLM, on behalf of the DFG, has prepared conclusions and recommendations for further research, published in this volume together with oral and poster contributions.

The SKLM is grateful to the DFG for sustained support of the SKLM symposia series. These symposia represent an excellent forum to discuss with recognized scientific experts topics of particular importance. I would like to thank the participants for their scientific contributions, as well as the members and guests of the Senate Commission for their support in preparing this publication. I am also grateful to the members of the editorial committee, chairs and rapporteurs, Prof. Hengstler, Prof. Joost, Prof. Kulling, Prof. Rietjens, Prof. Schlatter, Prof. Steinberg and Prof. Marko, for their contributions to the conclusions and recommendations. Thanks are also due to Dr. Sabine Guth, Dr. Michael Hab-ermeyer and Dr. Barbara Kochte-Clemens of the Scientific Office of the SKLM who substantially contributed to the preparation of this volume. I am indebted to Dr. Heike Strelen, Head of the DFG Life Sciences Division 1, for her sustained support of the Senate Commissions activities. The SKLM trusts that this report, encompassing contributions, conclusions and recommendations will find due attention in research and health policy.

Prof. Dr. Gerhard Eisenbrand

Chair of the DFG Senate Commission on Food Safety

1

Bericht und Schlussfolgerungen

1.1 Einleitung

Pflanzliche Lebensmittel sind ein wichtiger Bestandteil der Ernährung, einige Pflanzen jedoch enthalten Stoffe, die bestimmte gesundheitliche Risiken bergen. Solche “sekundären Pflanzenstoffe” können unerwünschte Wirkungen über verschiedene Mechanismen auslösen. So wirken einige Stoffe auf das Hormonsystem, wie beispielsweise die in Soja enthaltenen Isoflavone. Andere Stoffe wirken lebertoxisch (Cumarin), neurotoxisch (Solanin), phototoxisch (Furocumarine) oder kanzerogen (Estragol). Bei einer normalen Aufnahme als natürliche Bestandteile von Obst, Gemüse, Kräutern und Gewürzen geht man von einem geringen Risiko aus. Potenziell problematisch jedoch ist eine erhöhte Exposition, z. B. bei einseitiger Ernährung oder bei Einnahme über Nahrungsergänzungsmittel in isolierter und konzentrierter Form.

Für eine Risikoabschätzung sind Stoffe zu identifizieren, die aufgrund ihrer chemischen Struktur potenziell gesundheitsschädlich sind und deren Wirkungen im Organismus unter Bezug auf die Dosis zu klären sind. Hierfür werden zunehmend neuartige Profilierungstechniken und rechnergestützte Methoden eingesetzt – mit vielversprechenden Möglichkeiten.

Die Senatskommission zur gesundheitlichen Bewertung von Lebensmitteln (SKLM) der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) hat ein Symposium zum Thema “Risk Assessment of Phytochemicals in Food – Novel Approaches” organisiert, das vom 30. März bis 1. April 2009 in Kaiserslautern, Deutschland, stattfand. Potenziale, Auswirkungen und Perspektiven neuartiger Methoden für die Risikoabschätzung unter Einschluss von in-silico-, in-vitro- und in-vivo- Ansätzen wurden diskutiert und der Stand der Technik unter Berücksichtigung spezifischer Beispiele aus dem Bereich der sekundären Pflanzenstoffe ermittelt. Ziel des Symposiums war, die Bedeutung neuer Methoden für die Risikoabschätzung dieser Stoffe herauszuarbeiten. Die SKLM hat hieraus Schlussfolgerungen und Empfehlungen abgeleitet und Wissenslücken sowie Forschungsbedarf identifiziert. Dieser Bericht basiert auf den Präsentationen von Marcel Leist (DE), Gerrit Speijers (NL), Luis Valerio (US), Benoît Schilter (CH), Ivonne Rietjens (NL), Pablo Steinberg (DE), Hans-Jürgen Ahr (DE), Anette Thiel (CH), Hennicke Kamp (DE), Hannelore Daniel (DE), Augustin Scalbert (FR), Theo de Kok (NL), Takeki Uehara (JP), Alfonso Lampen (DE), Dieter Schrenk (DE), Jaap Keijer (NL), Ulrike Peters (US), Hansruedi Glatt (DE), Johanna Fink-Gremmels (NL) sowie den Diskussionen in den anschließenden Workshops.

1.2 Methodenübergreifende Aspekte

Nahrung und Lebensmittelinhaltsstoffe gelten, ganz gleich ob natürlichen oder synthetischen Ursprungs, als expositions-/ ernährungsbedingte Faktoren, die die menschliche Gesundheit über ihre Einwirkung auf das Genom, das Transkriptom, das Proteom und das Metabolom beeinflussen. Da solche Wechselwirkungen das ganze Leben hindurch bestehen, ist auch der physiologische und Entwicklungszustand eines Individuums zum Zeitpunkt der Exposition von Bedeutung. Neue Profilierungstechniken (profiling techniques) bieten die Möglichkeit, Wechselwirkungen zwischen Lebensmittelbestandteilen und Rezeptoren, Signalwegen und anderen Teilen des Genom-/ Transkriptom-/ Proteom-/ Metabolom-Systems zu identifizieren, die das physiologische Gleichgewicht sicherstellen.

Die Risikobewertung von Lebensmitteln und ihren Inhaltsstoffen hat eine große Zahl natürlicher oder synthetischer Stoffe, die die menschliche Gesundheit beeinflussen können, in Betracht zu ziehen. Da für die meisten dieser Substanzen keine ausreichenden toxikologischen Daten zur Verfügung stehen, erhofft man sich von den neuen molekularen Techniken schnelle, effiziente und verlässliche Informationen, die es ermöglichen, sichere Expositionsgrenzwerte zu etablieren oder für (pflanzliche) Stoffe eine adäquate Risikoabschätzung auf der Basis angemessener Sicherheitsprüfungen durchzuführen. Eine Vielfalt neuer Methoden befindet sich derzeit in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung und Anwendung.

Die SKLM hält deren Einsatz zum Erreichen der folgenden Ziele für wesentlich:

Aufklärung von Wirkmechanismen

Entwicklung neuer Techniken, die eine umfassende Auswertung großer Datensätze erlauben

Vergleich experimenteller Daten aus Tierversuchen oder in-vitro-Modellsystemen mit Daten aus Humanstudien

Wissenschaftsgeleitete Entwicklung von Lebensmitteln und Lebensmittelin-haltsstoffen mit definierter Biofunktionalität

Berücksichtigung individueller Variabilität und Prädisposition.

Solche neuen Methoden könnten in klinischen und tierexperimentellen Studien dazu dienen, Daten höherer Aussagequalität zu generieren bzw. ein besseres Verständnis von scheinbar inkonsistenten Daten zu gewinnen. Durch die Einführung molekularer Marker können in künftigen epidemiologischen Studien biomolekulare Angriffspunkte und Effekte sekundärer Pflanzenstoffe eingehender untersucht werden. Hierdurch können Wechselwirkungen sekundärer Pflanzenstoffe mit biomolekularen Prozessen, aber auch die Rolle der genetischen Variabilität humaner Populationen bei der Auslösung heterogener Reaktionen durch sekundäre Pflanzenstoffe besser verstanden werden.

1.3 Methoden

1.3.1 Rechnergestützte Toxikologie/in-silico-Modelle

In-silico-Technologien verwenden rechnergestützte Informationen und Methoden, um das toxikologische bzw. Wirk-Profil einer Substanz zu prognostizieren. Sie ermöglichen die Überprüfung einer großen Zahl an Substanzen innerhalb einer relativ kurzen Zeit und sind sehr kosteneffizient verglichen mit konventionellen toxikologischen Tierstudien. Sie können darüber hinaus experimentell vielseitig eingesetzt werden, nicht nur für das Screening, sondern auch, um mittels adäquater Lernalgorithmen ihre Vorhersagekraft zu verfeinern. Dies gilt beispielsweise für Ansätze auf der Basis quantitativer Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (quantitative structure-activity relationship, QSAR) oder des physiologiebasierten Biokinetik-Modellierens (physiologically-based biokinetic modelling, PBBK). Ein weiterer Vorteil von in-silico-Methoden zur Voraussage von Toxizität liegt im potenziellen Einsparungseffekt bei der Zahl der Versuchstiere, so dass Tierversuche eingeschränkt bzw. sogar ersetzt und damit ein Beitrag zum 3R-Prinzip (refinement, reduction, replacement) geleistet werden kann. Darüber hinaus erscheint der Einsatz von in silico rechnergestützten Toxikologie-Methoden (computational toxicology) für einzelne pflanzliche Substanzen zur Priorisierung der Risikoabschätzung auf chemischer Basis sehr vielversprechend.

1.3.1.1 Quantitative Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (QSAR)

Definition:

QSAR-basierte Methoden korrelieren quantitativ Parameter, die strukturelle chemische Eigenschaften von Molekülreihen beschreiben, mit deren biologischer Aktivität oder chemischer Reaktivität. Rechnergestützte prädiktive Modellierung auf der Basis von QSAR verwendet statistische Verfahren zur Korrelation von biologischer Aktivität von Molekülen mit Deskriptoren, die für eine Molekülstruktur repräsentativ sind.

Stand der Technik:

Rechnergestützte prädiktive Modellierung auf der Basis von QSAR liefert ein evidenzbasiertes Werkzeug zur Priorisierung und zur effizienten Gefährdungseinschätzung auf der Grundlage bereits vorhandener Testdaten zu unterschiedlichen Endpunkten. Solche Endpunkte umfassen z. B. das mutagene Potenzial von synthetischen und natürlichen Molekülen sowie pflanzlichen Stoffe, die in Pflanzenextrakten, Kräutern und natürlichen Nahrungsquellen zu finden sind. Prädiktive QSAR-Methodiken sind vielversprechende Entscheidungshilfen in der Sicherheits- und Risikobewertung. In dringenden Fällen könnten sie sich für eine schnelle Entscheidungsfindung als wertvoll erweisen und auch die Prioritätensetzung für zusätzliche Toxizitätstests unterstützen.

Limitierungen, Wissenslücken und Forschungsbedarf:

Die Stoffevaluierung auf der Basis von QSAR erlaubt keine absolute Sicherheit der Aussage in Bezug auf die gesundheitliche Unbedenklichkeit des betreffenden Stoffes. Auch weisen die Programme nicht alle notwendigen Funktionen auf und bieten keine völlig umfassende Information zu den Stoffeigenschaften oder eine 100%ige Spezifität. Die meisten QSAR-basierten prädiktiven Modelle der Stoffevaluierung sind außerdem begrenzt durch ihre inhärent geringe Empfindlichkeit in Bezug auf die Fähigkeit, echte Positive (true positives) richtig zu identifizieren. Exposition oder Spezifität des Angriffspunktes von Stoffen werden nicht gewichtet und mechanistische Gesichtspunkte, unter Einbezug klassenspezifischer Mechanismen, wie z. B. bei der Kanzerogenese die vielfachen Einzelschritte der Krebsstehung, Tumorpromotion oder Tumorart, spielen keine Rolle. Eine Kombination von Softwareprogrammen wäre die beste Möglichkeit, die Sensitivität und Spezifität der Vorhersage zu verbessern, da Datenbasen, Algorithmen und Methoden zur strukturellen Interpretation von Programm zu Programm variieren. Derzeit können Prognosen mit relativ guter Empfindlichkeit und Spezifität für bestimmte Endpunkte, wie etwa für die Mutagenität erstellt werden. Letztere hängt von einer begrenzten Zahl an Mechanismen ab, wie etwa der Fähigkeit von Stoffen, kovalent an die DNA zu binden. Dies gilt auch für die akute Toxizität in aquatischen Spezies, insbesondere dann, wenn ein “narkotischer” Mechanismustypus verantwortlich ist. Sehr viel schwieriger ist es hingegen, komplexere Endpunkte wie Organtoxizität oder Kanzerogenität vorherzusagen, die auf einer Vielzahl möglicher Mechanismen beruhen.

Derzeit sind Datenbanken limitiert und Daten über eine ausreichende Zahl an Substanzen nicht vorhanden. Diese Einschränkungen beruhen aber vor allem auf fehlenden rechnerischen Möglichkeiten, weniger auf den Einschränkungen von Datenbanken.

Zum jetzigen Zeitpunkt kann man mit Hilfe rechnergestützter QSAR-basierter Toxikologie-Methoden einzelne chemische Substanzen analysieren. Komplexe Gemische, wie etwa pflanzliche Extrakte, können jedoch noch nicht auf diese Weise analysiert werden. Gleichwohl könnten sich in Zukunft rechnergestützte Techniken besonders bei der Bewertung pflanzlicher Gemische und der Voraussage additiver oder synergistischer Effekte als gewinnbringend erweisen.

1.3.1.2 Physiologie-basierte biokinetische Modelle (PBBK)

Definition:

Das Physiologie-basierte biokinetische Modell (PBBK) umfasst einen Satz mathematischer Gleichungen, die auf der Grundlage dreier Parametertypen gemeinsam die Charakteristik von Absorption, Verteilung, Metabolismus und Exkretion (ADME; absorption, distribution, metabolism and excretion) eines Stoffes innerhalb eines Organismus beschreiben. Diese Parameter umfassen Physiologie (z. B. Herzleistung, Gewebevolumen und Gewebedurchblutung), Physiko-Chemie (z. B. Blut/Gewebe-Verteilungskoeffizienten) und Kinetik (z. B. kinetische Konstanten für metabolische Reaktionen).

Stand der Technik:

Ein generelles Problem bei der Risikoabschätzung ist die Notwendigkeit, tierexperimentelle Daten bei hohen Dosen auf die humane Niedrigdosis-Situation zu extrapolieren. Solche Extrapolationen werden erschwert durch Unsicherheiten bezüglich der Dosis-Wirkungs-Kurve im Dosisbereich, wie er für die menschliche Ernährung relevant ist, sowie durch speziesspezifische Unterschiede im Metabolismus.

PBBK-Gleichungen können z. B. den zeitlichen Verlauf der Gewebskonzentration eines Stoffes oder seiner Metaboliten in jedem Gewebe bei jeder Dosierung vorausberechnen und damit die Analyse von Effekten im niedrigen Dosisbereich, wie er für die humane in-vivo-Situation realistisch ist, ermöglichen. Modellvorhersagen können genutzt werden, um eine stärker mechanismusgetriebene Grundlage zur Einschätzung der Wirkungen in Tieren und Menschen bei niedrigen, nahrungsbezogenen Aufnahmemengen zu liefern, selbst wenn diese nur auf in-vitro-Daten beruhen. Darüber hinaus können PBBKModelle für verschiedene Spezies entwickelt werden, was die Extrapolation von Spezies zu Spezies erleichtert. Auch ist es möglich, durch Einbezug von Gleichungen und kinetischen Konstanten für metabolische Umsetzungen, die aus Proben einzelner humaner Individuen und/ oder spezifischer Isoenzyme gewonnen werden, eine Modellierung interindividueller Variationen und genetischer Polymorphismen durchzuführen. Internationale Standardverfahren und Datenbanken, die eine Standardisierung und Transparenz der Erstellung von PBBK-Modellen gewährleisten, sind bereits verfügbar.

Limitierungen, Wissenslücken und Forschungsbedarf:

Einen besonderen Schwerpunkt in der Risikobewertung beansprucht die Beurteilung von Langzeiteffekten, wie z. B. Kanzerogenität. Tierexperimentelle Untersuchungen hierzu werden in der Regel mit einer einzigen definierten Substanz durchgeführt. Der Mensch ist aber gegenüber sekundären Pflanzenstoffen über die Nahrung exponiert, d. h. ein bestimmter Stoff wird innerhalb eines komplexen Gemisches mit anderen Inhaltsstoffen aufgenommen. In der Lebensmittelmatrix können verschiedene Interaktionen stattfinden, die die Bioverfügbarkeit bestimmter Lebensmittelbestandteile beeinflussen. Zudem können auf der Ebene der metabolischen Aktivierung und/ oder Entgiftung Wechselwirkungen mit anderen pflanzlichen Inhaltsstoffen stattfinden. Grundsätzlich sind PBBK-Modelle in der Lage, solche modulierenden Effekte pflanzlicher Inhaltsstoffe in komplexen Gemischen mit einzubeziehen.

Gegenwärtige Modelle berücksichtigen vorausberechnete Daten zu dosisabhängigen Effekten, Speziesunterschieden und interindividuellen Unterschieden in der Bioaktivierung. Für eine adäquate Abschätzung des Krebsrisikos bei Expositionen, die für den Menschen relevant sind, sind aber nach wie vor noch Zusatzinformationen erforderlich. Beispielsweise beeinflusst auch die Toxikodynamik die Risikobewertung. Dies lässt sich durch Erweiterung der PBBK-Modelle in so genannte Physiologie-basierte biodynamische Modelle (PBBD-Modelle, physiologically-based biodynamic models) untersuchen. Hierbei werden Dosishöhe und Biotransformation verknüpft mit Biomarkern der Exposition oder der Toxizität bzw. letztlich der Krebsrate.

Eine der stärksten Einschränkungen des PBBK-Modellierens besteht derzeit darin, dass ein Modell für jeden einzelnen Stoff aufwendig etabliert werden muss. Diese Validierung ist aber für eine ganze Reihe von Stoffen notwendig. Es lässt sich trotzdem absehen, dass die Bedeutung des PBBK-Modellierens mit sich allmählich erhöhender Verfügbarkeit von Modellen guter Qualität zunehmen wird. Insbesondere in der Kombination mit in-vitro-Tests kann die PBBK-Modellierung bei der Extrapolation von in-vitro-Konzentrations-Wirkungs-Kurven hin zu in-vivo-Dosis-Wirkungs-Kurven sehr hilfreich sein. Dies lässt sich dadurch bewerkstelligen, dass Konzentrations-Wirkungs-Kurven aus einem geeigneten in-vitro-Toxizitätstest als interne Konzentrationen im Modell verwendet werden. Mit Hilfe des PBBK-Modells lassen sich dann die in-vivoDosishöhen errechnen, die zum Erreichen der internen (toxischen) Konzentrationen erforderlich sind. Die so vorausberechneten Dosis-Wirkungs-Kurven können bei der Sicherheitsbewertung von Stoffen für die Bestimmung sicherer Expositionswerte verwendet werden. Auf diese Weise können PBBK-Methoden helfen, externe Dosen mit internen Konzentrationen (Zielgewebedosis) zu verknüpfen und diese internen Konzentrationen mit EC50-Werten (effective concentration 50%) aus in-vitro-Studien zu verbinden und umgekehrt.

1.3.2 Techniken zur Profilerstellung: “OMICS”, in-vitro- und in-vivo-Modelle

Der Ausdruck “OMICS” bezieht sich auf eine Reihe von Disziplinen, die biologische Informationen zu Wechselwirkungen von Stoffen mit dem Genom, Proteom und dem Metabolom analysieren. Diese umfassen eine Vielfalt von Unterdisziplinen, die verschiedene Gruppen von Techniken, Reagenzien und Software verwenden, wie z. B. die DNA- und Protein-Microarray-Analyse, Gasund Flüssigchromatographie, Massenspektrometrie und eine Reihe anderer Methoden, die Analysen mit hohem Durchsatz ermöglichen. Eine der Stärken der “OMICS” liegt darin, dass sie gleichermaßen gut sowohl für in-vitro- als auch für in-vivo-Studien angewendet werden können.

Die Genomik umfasst sowohl die “Strukturelle Genomik”, DNA-Sequenzanalyse, Genomkartierung eines Organismus, als auch die “Funktionelle Genomik”, die Charakterisierung der Genwirkung, mRNA-Analyse und Proteinexpressionsprofilierung. Eine spezifischere Disziplin, die Proteomik, befasst sich mit der Untersuchung des vollständigen Proteinsatzes, der in einer Zelle, einem Gewebe, einer Körperflüssigkeit oder einem Organismus exprimiert wird. Im Unterschied zum Genom variiert das Proteom von Zelltyp zu Zelltyp. Die Proteomik versucht, Proteinprofile einzelner Zelltypen zu identifizieren und die Unterschiede im Proteinexpressionsmuster zwischen gesunden und kranken Zellen zu bewerten. Jedoch hat das Symposium den Schwerpunkt auf die Transkriptomik und Metabolomik gelegt und die Proteomik nicht explizit behandelt.

1.3.2.1 Transkriptomik

Definition:

Die Transkriptomik umfasst die globale Analyse der Genexpression. Man nennt sie auch die “Genomweite Expressionsprofilerstellung”. Sie erfasst den relativen Gehalt an Boten RNA (mRNA), um Muster der Genexpression und der Genexpressionshöhe zu bestimmen, und um die Genregulation zu analysieren.

Stand der Technik:

Zwar ist die m-RNA nicht das endgültige Produkt der Genexpression, die Transkription stellt aber den ersten Schritt in der Genregulation dar. Informationen bezüglich der Transkriptionshöhe werden benötigt, um Genregulationsnetzwerke besser zu verstehen und Ähnlichkeiten in Genexpressionsmustern aufzudecken, die funktional verbunden sind und dem gleichen genetischen Kontrollmechanismus unterliegen können. Die Analyse des gesamten Genoms/Transkriptoms stellt dabei einen unvoreingenommenen Ansatz (unbiased approach) dar, der die Identifizierung aller potenziellen (erwarteten/ unerwarteten) Effekte erlaubt.

RNA-Expressionssignaturen, die eine Unterscheidung zwischen verschiedenen Stoffklassen, wie etwa genotoxischen oder nicht genotoxischen Leberkarzinogenen erlauben, sind bereits identifiziert. Für eine Risiko-Nutzen-Analyse von sekundären Pflanzenstoffen können auch spezifische genetische Polymorphismen einbezogen werden. Darüber hinaus wird die Modulation der Expression von Genen, die an biologischen und genetischen Signalwegen beteiligt sind, welche für die Krebsentstehung Bedeutung haben, als eine wichtige Komponente des antikanzerogenen Effekts von Gemüse oder sekundären Pflanzenstoffen angesehen.

Die Transkriptomik kann bei der Untersuchung solcher Effekte sehr hilfreich sein.

Limitierungen, Wissenslücken und Forschungsbedarf:

Die Modulation der Transkriptionshöhe ist nicht unbedingt mit entsprechenden Änderungen auf Proteinebene verbunden. Zumindest für spezifische Gene sollten Daten zur RNA-Expression durch die Bestimmung der entsprechenden Proteinkonzentrationen oder -aktivitäten ergänzt werden. Je nach dem Gewebskontext kann auch alternatives Spleißen die Funktionalität beeinflussen.

Das Erstellen von Transkriptionsprofilen führt zu extrem großen Datensätzen und benötigt effektive Datenbankressourcen für Interpretation, Management und Analyse. Ob genomweite Expressionsdaten für Routineanwendungen erforderlich sind, muss noch untersucht werden. Möglicherweise benötigt man die Genomik nur für die Identifikation von Gengruppen, die die Etablierung eines Klassifikationsalgorithmus erlauben. Falls die Zahl an Genen, die für die Klassifikation benötigt werden, nicht zu hoch ist, könnten diese mittels quantitativer Techniken analysiert werden, wie z. B. qRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction).

Die Interpretation der Genexpressionsdaten sollte durch validierte Biomarker unterstützt werden. Zum besseren Verständnis der komplexen Information, die man normalerweise erhält, sollten integrierte systembiologische Ansätze entwickelt werden.

1.3.2.2 Metabolomik

Definition:

Die Metabolomik hat zum Ziel, das Profil aller Metaboliten in einem einfachen System, z. B. einer Zelle, oder im komplexen System, z. B. Organ oder Organismus, zu untersuchen.

Stand der Technik:

Die Metabolomik verwendet hoch entwickelte instrumentell-analytische Techniken, wie Kernmagnetresonanzspektroskopie (NMR) und Massenspektrometrie (MS), meistens in Kopplung mit verschiedenen Trenntechniken wie Gaschromatographie (GC) oder Flüssigchromatographie (LC). Mit Hilfe dieses Instrumentariums kann das endogene und das mit einer Exposition verbundene Metabolom eines Organismus charakterisiert und die Bestandteile der verschiedenen Stoffwechselwege identifiziert werden. Eine Stärke der Metabolomik liegt darin, dass sie das Potenzial bestimmter Nährstoffe und von Xenobiotika erfasst, die Stoffwechseleigenschaften eines Organismus zu verändern. Dabei kann es sich beispielsweise um metabolische Leberfunktionen, Insulinempfindlichkeit von Geweben oder die Sekretion von Schilddrüsenhormonen handeln. Ein weiterer Vorteil liegt in der Möglichkeit der Analyse von Stoffwechselspektren in menschlichem Blut und Urin. So ist es möglich, mittels Metabolomik den Einfluss von Nahrungsbestandteilen im Menschen zu untersuchen.

Limitierungen, Wissenslücken und Forschungsbedarf:

Die Metabolomik deckt den Anteil am gesamten Metabolom ab, der mittels instrumenteller Analyse zugänglich ist. Allerdings bestehen trotz großer Fortschritte im Verständnis metabolischer Profile oft Unklarheiten bezüglich der Interpretation der komplexen Daten. Da viele Inhaltsstoffe über mehrere Mechanismen agieren, kann die Situation komplex werden. Darüber hinaus sind Effekte von Gemischen auf das Metabolom bisher nicht untersucht.

Es besteht Bedarf, die quantitative Erfassung metabolischer Daten zu standardisieren. Zusätzlich sollte eine standardisierte Plattform für den Datenaustausch etabliert werden. Die statistische Auswertung muss soweit verbessert werden, dass induzierte Effekte klar von der physiologischen Streubreite im Metabolom unterschieden werden können. Für die Voraussage von Wirkmechanismen müssen generell einsetzbare Algorithmen etabliert und validiert werden.

1.3.2.3 Toxikogenomik und Nutrigenomik

Definition:

Toxikogenomik und Nutrigenomik sind Sammelbegriffe, welche die drei Unterdisziplinen Transkriptomik, Proteomik und Metabolomik mit einschließen. Diese Techniken zur Profilerstellung können aus ernährungsbezogenem oder aus toxikologischem Blickwinkel heraus betrachtet werden. Der Ausdruck Toxikogenomik wird verwendet, wenn die Toxikologie mit diesen neuen Methoden kombiniert wird, um die toxischen Wirkungen spezifischer Stoffe besser zu verstehen und zu erfassen, während die Nutrigenomik den Einfluss bestimmter Nährstoffe oder Ernährungsweisen auf die Genexpression untersucht. Dies sollte nicht mit dem Ausdruck “Nutrigenetik” verwechselt werden, bei der untersucht wird, wie die genetische Variabilität die Reaktion des Körpers auf Nahrungsbestandteile bzw. auf die Ernährung beeinflusst.

Stand der Technik:

Die Toxikogenomik birgt großes Potenzial, spezifische toxische Effekte von Wirkstoff-Kandidaten und Stoffen vorherzusagen. Ziele der Toxikogenomik sind, Biomarkergene zu identifizieren und Zusammenhänge zwischen Änderungen in Genexpressionsmustern und bestimmten toxikologischen Endpunkten festzulegen. Man geht davon aus, dass eine Kurzzeitexposition Änderungen in den RNA-, Protein- und Metaboliten-Expressionsmustern verursacht, welche sich auch als hilfreich bei der Vorhersage von Langzeiteffekten erweisen könnten. Darüber hinaus konnte bereits überzeugend gezeigt werden, dass diese Techniken starke Hinweise auf toxische Mechanismen liefern können, die durch die zu prüfenden Verbindungen ausgelöst werden.

Die Nutrigenomik birgt das Potenzial, innerhalb wohl definierter Versuchsbedingungen Hunderte von Messgrößen zu charakterisieren, die auf einen bestimmten Nährstoff oder Nichtnährstoff, auf eine Behandlung oder Ernährungsweise reagieren.

Einschränkungen, Wissenslücken und Forschungsbedarf:

Toxikogenomische Untersuchungen und daraus abgeleitete KlassifikationsAlgorithmen beschränken sich bisher nur auf eine sehr begrenzte Zahl an Stoffen. Dosis-Wirkungs-Beziehungen sind bisher nur in sehr wenigen Fällen etabliert worden. Dies könnte sich als problematisch erweisen, da die gleiche Verbindung bei hoher bzw. niedriger Konzentration jeweils über unterschiedliche Mechanismen wirken kann. Für die Zukunft ist es wichtig, “OMICS”-Daten einer großen Zahl von Stoffen, die über gut definierte Mechanismen wirken, zu etablieren. Nur wenn Daten zu einer ausreichend großen Zahl von Stoffen derselben Stoffklasse verfügbar werden, können koordinierte Änderungen in den Transkripten, Proteinen oder Metaboliten identifiziert und mit gemeinsamen molekularen (toxischen) Wegen in Verbindung gebracht werden. Solche Schlüsselwege und deren Zusammenhänge mit biochemischen Daten müssen noch identifiziert werden. Ebenso müssen Änderungen im Expressionsmuster von Genen, Proteinen und Metaboliten sowohl mit nachteiligen, als auch positiven Effekten auf die menschliche Gesundheit verknüpft werden, um die bislang noch limitierte Aussagekraft für die Risikobewertung zu verbessern. Von wesentlicher Bedeutung ist der Aufbau einer öffentlich zugänglichen, umfassenden, gut strukturierten und harmonisierten Toxikogenomik-Datenbank mit Informationen zu Expressions- und toxikologischen Parametern.

Für adäquate Ernährungsstudien (Nutrigenomik-Studien) bedarf es gut geplanter experimenteller Untersuchungen an Freiwilligen unter standardisierten Bedingungen in Bezug auf Ansatz, Ernährung und Profilerstellung. Die gegenwärtige Problematik gleicht derjenigen der Toxikogenomik und besteht vor allem darin, die durch die Nutrigenomik generierten großen Datensätze angemessen zu interpretieren. Koordinierte Änderungen bei Transkripten, Proteinen und Metaboliten können nur in wenigen Fällen und auf bekannte Regulationswege projiziert werden. Eine weitere Einschränkung rührt daher, dass sich die Expressionsprofile verschiedener Gewebe unterscheiden und oft nicht klar ist, welches Gewebe relevant ist. Während in Tiermodellen die Gewebe recht umfassend analysiert werden können, ist dies in Humanstudien nicht möglich.

1.4 Schlussfolgerungen und Empfehlungen

In-silico- und in-vitro-Techniken zur Identifizierung von Gefährdungen können ebenso wie in-vitro-Techniken zur Prüfung bestimmter mechanistischer Endpunkte die Sicherheitsbewertung von pflanzlichen Stoffen mittels gezielten Studiendesigns verbessern. Darüber hinaus lässt sich mittels solcher in-silico- und in-vitro-Untersuchungen die Anzahl der für Wirksamkeits- und Sicherheitsstudien erforderlichen Tiere reduzieren. Hierzu können auch neue in-vivo-Techniken beitragen und ebenso die Versuchsdauer verkürzen, wenn auf der Basis von Ergebnissen aus “Kurzzeit”-Studien “Langzeit”-Effekte wie Kanzerogenität vorhergesagt werden können.

Die SKLM vertritt die Ansicht, dass die neuen Methoden bislang noch nicht aussagekräftig genug sind, um die derzeitigen Verfahren der Stoffprüfung und Risikobewertung zu ersetzen. Sie werden aber als sehr nützlich angesehen, um umfassendere Daten zu erhalten und somit die Auswertung von klinischen und tierexperimentellen Studien zu verbessern bzw. inkonsistente Daten besser zu verstehen. Darüber hinaus können sie mechanistische Einblicke ermöglichen, die in die Risikobewertung einbezogen werden können. Gleichwohl ist eine stringente Validierung unter Einbezug des Vergleichs mit klassischen Verfahren erforderlich, um die Verwendbarkeit für einen bestimmten Zweck abzusichern.

Um größtmöglichen Erkenntnisgewinn zu erhalten, wird eine neue Teststrategie empfohlen, bei der verschiedene Methoden in einem kombinierten Ansatz integriert werden. Um Standardisierung, Vergleichbarkeit, Reproduzierbarkeit sowie die Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Laboratorien zu gewährleisten, ist Planung, Design und Aufbau einer öffentlich zugänglichen, umfassenden, gut strukturierten und harmonisierten Datenbank notwendig. Dies beschleunigt den Validierungsprozess und stellt sicher, dass die neuen Methoden angemessen angewendet werden. Bioinformatikexperten sind unerlässlich, um diese Ziele zu erreichen.

Bei der Durchführung von Humanstudien muss der genetische Hintergrund der analysierten Population berücksichtigt werden. Der Aufbau einer umfassenden Datenbank zur physiologischen Hintergrundsituation von Individuen sowie der Allgemeinbevölkerung ist eine Voraussetzung für die Untersuchung des Einflusses von Stoffen auf humane Stoffwechselmuster. Die genetische Variabilität kann so besser berücksichtigt werden, und man kann möglicherweise Schlüsselfaktoren identifizieren, die für die Variabilität in der zu untersuchenden Population verantwortlich sind.

Menschen sind normalerweise gegenüber pflanzlichen Stoffen in komplexen Stoffgemischen exponiert. Zum gegenwärtigen Zeitpunkt sind die meisten modernen Techniken aber nicht in der Lage, solche Gemische zu handhaben. Bis jetzt wurden “OMICS”-Techniken fast ausschließlich zur Analyse einzelner Substanzen und nicht von Gemischen angewendet. Das ist sinnvoll, da zunächst die bereits sehr komplexen Effekte einzelner Bestandteile identifiziert und verstanden werden müssen. Dennoch ist ein Vorteil der auf Mustern beruhenden “OMICS”-Technologien, dass es irrelevant ist, ob die Änderungen in komplexen Expressionsmustern durch Einzelsubstanzen oder Gemische verursacht werden. Daher wird mit fortschreitender Entzifferung der komplexen Sprache der “OMICS”-Muster für Einzelstoffe diese Methodik auch für Gemische anwendbar werden, was rasche Fortschritte auf dem Forschungsgebiet insgesamt mit sich bringen wird. Schließlich liegt ein einzigartiger Vorzug der “OMICS”-Techniken mit ihrem Zufalls- oder gar genomweiten Ansatz darin, auch solche Effekte zu entdecken, die gar nicht gesucht wurden. Daher ist es wahrscheinlich, dass sie bei zusätzlicher Anwendung gemeinsam mit konventionellen Toxizitätstests die Risikobewertung verbessern werden.

1.4.1 Spezifischer Forschungsbedarf in Schlagworten

QSAR:

Verstärkte Erforschung der Möglichkeit einer Kombination von Softwareprogrammen zur Verbesserung von Sensitivität und Spezifität der Vorhersage

Weiterentwicklung der Software, um Informationen aus Datenbanken intelligenter nutzbar zu machen

Entwicklung von rechnergestützten Verfahren zur Bewertung von Stoff-gemischen.

PBBK:

Erweiterung der PBBK-Modelle in so genannte Physiologie-basierte biodynamische Modelle (PBBD-Modelle, physiologically based biodynamic models)

Entwicklung weniger aufwendiger Methoden, um eine große Zahl von Stoffen modellieren zu können

Kombination von in-vitro-Toxizitätstests mit in-vivo- Dosis-Wirkungskurven.

Transkriptomik:

Ergänzung von Daten zur RNA-Expression durch Bestimmung der entsprechenden Proteinkonzentrationen oder -aktivitäten, auch unter Berücksichtigung des alternativen Spleißens

Entwicklung effektiver Datenbankressourcen zur Unterstützung von Interpretation, Management und Auswertung für die Erstellung von Transkriptionsprofilen; Klärung, ob genomweite Expressionsdaten für Routineanwendungen erforderlich sind

Etablierung eines Klassifikationsalgorithmus

Entwicklung von validierten Biomarkern zur Interpretation der Genexpressionsdaten

Entwicklung von integrierten systembiologischen Ansätzen zum besseren Verständnis komplexer Daten.

Metabolomik:

Standardisierung der Bestimmung metabolischer Daten

Etablierung einer Plattform für den Datenaustausch

Untersuchung der Effekte von Gemischen auf das Metabolom

Verbesserung der statistischen Auswertung, so dass induzierte Effekte klar vom normalen Streubereich unterschieden werden können

Etablierung generell einsetzbarer Algorithmen für eine Prognose von Wirk-mechanismen.

Toxikogenomik and Nutrigenomik:

Gewinnung und Nutzung von Daten zu toxikogenomischen Untersuchungen, abgeleiteten Klassifikations-Algorithmen und Dosis-Wirkungs-Beziehungen von einer großen Zahl von Stoffen zur Identifizierung toxikologischer Schlüsselwege und deren Zusammenhänge mit biochemischen Daten

Beziehung zwischen Änderungen im Expressionsmuster von Genen, Proteinen und Metaboliten und nachteiligen oder positiven Effekten auf die menschliche Gesundheit

Aufbau einer öffentlich zugänglichen, umfassenden, gut strukturierten und harmonisierten Toxikogenomik-Datenbank mit Informationen zu Expressions- und toxikologischen Parametern

Durchführung gut definierter experimenteller Untersuchungen an Freiwilligen unter standardisierten Ernährungsbedingungen mit einem standardisierten Ansatz zur Durchführung adäquater Ernährungsstudien (NutrigenomikStudien),

Standardisierung der Anwendung der Profilerstellungstechniken.

1.5 Fazit

Die hier diskutierten neuen Methoden sind erfolgversprechend und können Prioritäten- und Entscheidungsfindung im Prozess der Risikobewertung stützen. Sie können aber derzeit die klassischen Methoden noch nicht ersetzen. In-silico-Methoden, wie etwa QSAR- und PBBK-Modelle, sind in Bezug auf regulatorische Auswirkungen und praktischen Einsatz am weitesten fortgeschritten, da sie in-vivo-Dosis-Wirkungs-Beziehungen für die Toxizität prognostizieren können.

Angesichts der immensen Datensätze, die anfallen, liegt eine Hauptaufgabe in der Interpretation. Eine hypothesen- und zweckgeleitete Methodenwahl ist daher, zusammen mit einer stringenten Validierung auf der Basis klassischer Methoden, unerlässlich.

Die weitere Entwicklung dieser vielversprechenden neuen Technologien erfordert umfassende Langzeitforschung auf der Basis einer nachhaltigen Förderung.

2

Report and Conclusions

2.1 Preface

Foods of plant origin are an essential part of the diet; however, some plants contain substances that hold certain health risks. Such “phytochemicals” can induce adverse effects by different mechanisms. Thus, some substances, for example soy isoflavones, affect the endocrine system. Other substances are hepatotoxic (coumarin), neurotoxic (solanine), phototoxic (furocoumarins) or carcinogenic (estragole). Normal intake of phytochemicals as natural components of fruits, vegetables, herbs, and spices is regarded to be of low risk. Increased exposure, however, poses a potential problem, for example in cases of unbalanced diets or uptake of dietary supplements in isolated and concentrated form. For risk assessment, it is necessary to identify potentially harmful substances based on their chemical structure. Also, their dose-dependent effects on the organism have to be described. For this purpose, novel profiling techniques and advanced computational methods are increasingly used, with promising possibilities.

The Senate Commission on Food Safety (SKLM) of the Deutsche For-schungsgemeinschaft (DFG) organized a symposium entitled „Risk Assessment of Phytochemicals in Food – Novel Approaches”that took place in Kaiserslautern, Germany from March 30th to April 1st 2009. Power, implications and promises of novel methodologies for risk assessment, including various in silico, in vitro and in vivo approaches were discussed and an evaluation of the state of the art for the various approaches was performed. Specific examples from the field of phytochemicals such as coumarin/ furocoumarins, beta-carotene, quercetin, glucosinolates and isoflavones were considered. The symposium addressed the relevance of the novel approaches for risk assessment of phytochemicals. The SKLM has elaborated conclusions and recommendations, also identifying gaps in knowledge and research needs. This report is based on the presentations of Marcel Leist (DE), Gerrit Speijers (NL), Luis Valerio (US), Benoît Schilter (CH), Ivonne Rietjens (NL), Pablo Steinberg (DE), Hans-Jürgen Ahr (DE), Anette Thiel (CH), Hennicke Kamp (DE), Hannelore Daniel (DE), Augustin Scalbert (FR), Theo de Kok (NL), Takeki Uehara (JP), Alfonso Lampen (DE), Dieter Schrenk (DE), Jaap Keijer (NL), Ulrike Peters (US), Hansruedi Glatt (DE), Johanna Fink-Gremmels (NL) and subsequent workshops.

2.2 Transdisciplinary Aspects

Diet and food components, irrespective of whether naturally occurring or manmade, are nowadays perceived as exposure/ nutrition related factors of influence on human health by affecting the genome, transcriptome, proteome and metabolome. In addition, since such interactions persist throughout life, the developmental and physiological status of an individual exposed at a given time in life is considered to be also of importance. New profiling techniques offer the possibility to identify interactions of food constituents with receptors, signalling pathways and other parts of the genome/ transcriptome/ proteome/ metabolome system involved in keeping our physiology in a balance.

Risk assessment of food and its ingredients has to consider a large number of man-made chemicals, as well as various naturally occurring compounds which might influence human health. Since for the vast majority of these substances the available toxicological data are insufficient, novel molecular techniques are expected to provide rapid, efficient and reliable information to establish safe levels of exposure or to perform an adequate risk assessment on (phyto-) chemicals based on appropriate safety testing. In view of the large variety of new methodologies, which are at different stages of development and applicability at the present time, the SKLM underlines the importance of using these methodologies when pursuing a number of aims such as:

The elucidation of mechanisms of action

The development of novel techniques to enable comprehensive validation of large datasets

The comparison of experimental data in laboratory animals or in vitro model systems with those obtained from studies on humans

The science-driven development of food and food ingredients with a defined biofunctionality

The consideration of individual variability and susceptibility.

Such novel methodologies might be useful to generate data of improved quality in clinical and animal studies or to achieve a better understanding of seemingly inconsistent data. Biomolecular targets and biological effects of specific phytochemicals might be more adequately investigated by introducing molecular markers in future epidemiological studies. By doing so, the interaction of phytochemicals with biomolecular processes as well as the role of genetic variability in the heterogeneous response of different human populations towards certain phytochemicals may be better understood.

2.3 Methodologies

2.3.1 Computational Toxicology/In Silico Models

In silico technologies use computational information and strategies to generate a predictable toxicological and adverse effect profile for a given compound. They allow the rapid screening of high numbers of chemicals in a relatively short period of time, and are very cost-effective when compared to conventional animal-based toxicology studies. Moreover, they can also be used in multiple experiments, not only to screen large numbers of chemicals but also to refine their predictive power through adequate learning algorithms including for example quantitative structure–activity relationship (QSAR)-based strategies or so-called physiologically-based biokinetic (PBBK) modelling. A further benefit of in silico methods for predicting toxicity and aiding in risk assessment of chemicals is the potential net effect of reducing, refining or even replacing the number of animals used for laboratory testing, thus contributing to the 3R principle (refinement, reduction, replacement). Furthermore, the use of in silico computational toxicology methods with individual phytochemicals appears of great promise to generate priorities for risk assessment on a chemical basis.

2.3.1.1 Quantitative Structure–Activity Relationship (QSAR)

Definition:

QSAR-based approaches quantitatively correlate parameters describing structural chemical characteristics of series of molecules with their biological activity or chemical reactivity. Computational QSAR-based predictive modelling applies statistical tools correlating biological activity of molecules with descriptors representative of a molecular structure.

State of the Art:

Computational QSAR-based predictive modelling provides an evidence-based tool for prioritization and an efficient estimate of hazard based on pre-existing test data regarding various end points. Such end points comprise e. g. the mutagenic potential of synthetic and naturally occurring molecules, including phytochemicals present in botanicals, herbs, and natural dietary sources. Predictive QSAR methodologies hold promise as a decision support tool in safety and risk assessment. They may be valuable in emergency situations to assist in fast decision making and may also help in defining priorities for additional toxicity testing.

Limitations, Gaps in Knowledge and Research Needs:

QSAR evaluation cannot ensure safety of a given substance with absolute certainty. Also, the programmes do not have all the needed functionalities nor do they give comprehensive information on the chemical properties or 100% coverage or specificity. Furthermore, like most QSAR-based predictive models, the method suffers from inherent poor sensitivity, i. e. the ability to correctly identify true positives. It does not weigh exposure, or target specificity of compounds nor is it guided by mechanistic considerations such as class-specific mechanisms, for instance in carcinogenesis the multiple steps in tumorigenesis, tumor promotion, or tumor type. The use of a combination of computational software programs would be the best approach to maximize sensitivity and specificity of the prediction, since databases, algorithms and methods for structural interpretation vary between programs. Presently, predictions can be made with relatively good sensitivity and specificity for end points such as mutagenicity, which depends on a limited number of mechanisms, for instance on the capacity to covalently bind to DNA, or for acute toxicity in aquatic species, especially when a narcotic type of mechanism is responsible. However, more complex end points depending on a multitude of possible mechanisms, such as organ toxicity or carcinogenicity are much more difficult to predict.

Currently, databases are limited and data on a sufficient number of compounds are missing. However, limitations are primarily due to current computational possibilities rather than to limited databases.

At the present time computational QSAR-based toxicology methods can be used to analyze individual chemicals, but they do not address the screening of complex mixtures such as botanical extracts. However, particularly for the evaluation of mixtures and prediction of additive or synergistic effects computational techniques may be of value in the near future.

2.3.1.2 PBBK-Modelling

Definition:

A physiologically-based biokinetic (PBBK) model is a set of mathematical equations that together describe the absorption, distribution, metabolism and excretion (ADME) characteristics of a compound within an organism on the basis of three types of parameters. These parameters include physiological parameters (e. g. cardiac output, tissue volumes, and tissue blood flows), physico-chemical parameters (e. g. blood/tissue partition coefficients), and kinetic parameters (e. g. kinetic constants for metabolic reactions).

State of the Art:

An overall problem in risk assessment is the need to extrapolate experimental data obtained in animal experiments at high dose levels to a low dose human situation. Uncertainties regarding the shape of the dose-response curve at dose levels relevant for dietary human intake and species differences in metabolism make such extrapolations difficult to be performed.

PBBK equations predict, for example, the tissue concentration of a compound or its metabolites in any tissue over time at any dose, also allowing analysis of effects at low dose levels that are more realistic with respect to the human in vivo situation. Model predictions can be used to provide a more mechanism-driven basis for the assessment of the effects in animals and humans at low dose dietary intake levels, even based on in vitro data only. Furthermore, such PBBK models can be developed for different species, facilitating interspecies extra-polation. In addition, by incorporating equations and kinetic constants for metabolic conversions obtained from samples of individual humans and/or specific isoenzymes, modelling of interindividual variations and genetic polymorphisms is possible. International standardized procedures and databases to ensure standardization and transparency of the PBBK model building are already available.

Limitations, Gaps in Knowledge and Research Needs:

Risk assessment puts particular emphasis on long-term effects such as carcinogenicity. Whereas animal carcinogenicity experiments usually are conducted with a single defined compound, humans are exposed to phytochemicals via the diet, i. e. within a complex mixture of other ingredients. In a food matrix, various interactions might occur, thereby affecting the bioavailability of particular food components. In addition, interactions with other herbal ingredients might occur at the level of metabolic activation and/or detoxification. In principle, PBBK models can take into consideration such modulating effects of herbal ingredients for complex mixtures.

Current models take into account the predicted data on dose-dependent effects, species differences and interindividual differences in bioactivation. However, for a complete assessment of the cancer risk under human-relevant intake conditions, additional information, such as toxicodynamic processes that might also affect the risk assessment, is still needed. This could be investigated by extending the PBBK models into so-called physiologically based biodynamic (PBBD) models, in which dose levels and biotransformation are coupled to biomarkers of exposure or toxicity and – ultimately – cancer incidence.

One of the major limitations of PBBK modelling is that nowadays models have to be established in a laborious way for each individual compound. However, validation of a broad range of compounds is required. Nevertheless, the importance of PBBK modelling will certainly augment in the future, when high quality models become increasingly available. Particularly in combination with in vitro tests PBBK modelling might be of great help in extrapolating in vitro concentration–response curves to in vivo dose-response curves. This is achieved by using the concentration–response curves, acquired in an appropriate in vitro toxicity test, as internal concentrations in the model. By using the PBBK model, the in vivo dose levels that are needed to reach the internal (toxic) concentrations can then be calculated. The predicted dose–response curves thus obtained can be used to determine safe exposure levels in chemical safety assessment. Thus, PBBK approaches will help to link external doses to internal concentrations (target tissue dose) and to link these internal concentrations to EC50 values from in vitro studies and vice versa.

2.3.2 Profiling Techniques: “OMICS”, In Vitro and In Vivo Models

The term “OMICS” refers to a field of disciplines analyzing biological information on the interaction of compounds with the genome, proteome and metabolome all of them ending in -omics (e. g. genomics, proteomics, metabolomics). It comprises a variety of subdisciplines using different sets of techniques, reagents and software like DNA and protein microarrays, gas and liquid chromatography, mass spectrometry and a number of other methodologies enabling high-throughput analyses. One of the strengths of “OMICS” lies in the fact that they can equally well be applied in studies being performed in vitro or in vivo.

Genomics includes “structural genomics”, DNA sequence analysis and mapping of the genome of an organism, as well as “functional genomics”, the characterization of gene responses, analyzing mRNA and protein expression profiles. As a more specific discipline, the study of the complete set of proteins expressed in a cell, tissue, body fluid or organism is referred to as proteomics. Unlike the genome, the proteome varies between cell types. Proteomics attempts to identify the protein profile of each cell type, and to assess differences in protein expression patterns between healthy and diseased cells. However, proteomics was not explicitly discussed at the symposium which focussed on transcriptomics and metabolomics.

2.3.2.1 Transcriptomics

Definition:

Transkriptomics refers to the global analysis of gene expression, also called “genome-wide expression profiling”, measuring relative amounts of messenger RNA (mRNA) in order to determine patterns and levels of gene expression, and to analyze gene regulation.

State of the Art:

Although mRNA is not the ultimate product of a gene, transcription is the first step in gene regulation, and information regarding transcript levels is needed to better understand gene regulatory networks and to detect similarities in expression patterns of genes, which may be functionally related and under the same genetic control mechanism. Whole genome transcriptome analysis provides an unbiased approach to the identification of all possible effects, intended (expected) effects as well as unexpected ones.

RNA expression signatures that allow differentiation between certain classes of compounds, such as genotoxic and non-genotoxic liver carcinogens, have already been identified. Specific genetic polymorphisms might be taken into account for risk–benefit analysis of phytochemicals. Furthermore, modulation of the expression of genes involved in biological and genetic pathways that are relevant to carcinogenesis is regarded as an important component of the anticarcinogenic effect of vegetables or phytochemicals. Transcriptomics can be helpful to study such effects.

Limitations, Gaps in Knowledge and Research Needs:

Modulation of transcription levels is not necessarily correlated to corresponding changes on the protein level. At least for specific genes, data on RNA expression levels should be complemented by determination of the respective protein levels or activity. Furthermore, alternative splicing may influence functionality, depending on the tissue context.

Transcript profiling produces extremely large datasets and requires effective database resources for interpretation, management and analysis. It remains to be studied whether genome-wide expression data will be required for routine applications. Possibly, genomics will only be required to identify sets of genes that allow the establishment of a classification algorithm. If the number of genes required for classification is not too high, they could be analyzed by a quantitative technique, such as qRT-PCR (quantitative real-time polymerase chain reaction).

Interpretation of gene expression data should be supported by validated biomarkers. To better understand the complex information usually obtained, integrated systems biology approaches should be developed.

2.3.2.2 Metabolomics

Definition:

Metabolomics intends to investigate the profile of all metabolites present in a simple system, e. g. a cell, or in a complex system, e. g. entire organ or organism.

State of the Art:

Metabolomics makes use of advanced analytical techniques including nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy as well as mass spectrometry (MS) which is mostly coupled with various separation techniques like gas chromatography (GC) and liquid chromatography (LC). These tools allow to characterize the endogenous and exposure related metabolome of an organism and to identify compounds of different metabolic pathways. A strength of metabolomics is its ability to identify the capacity of specific nutrients as well as xenobiotics to alter the metabolic properties of an organism such as for example metabolic liver functions, insulin sensitivity of tissues as well as thyroid hormone secretion. A further advantage is the possibility to analyze metabolic spectra in human blood and urine. Therefore, metabolomics can be applied to study the influence of dietary compounds in humans.

Limitations, Gaps in Knowledge and Research Needs:

Metabolomics covers the fraction of the entire metabolome accessible to instrumental analysis. However, although already much progress has been made in understanding metabolic profiles, it often is not clear how to interpret the complex data. Since many compounds act by several mechanisms the situation may become complex. Moreover, analysis of the effect of mixtures on the metabolome has not been addressed so far.

There is a need to standardize quantification of metabolomic data. In addition, a standardized platform for data exchange should be established. The statistical assessment needs to be improved to distinguish effects from the normal range of variations within the metabolome. Generalized algorithms for the prediction of the modes of action should be established and validated.

2.3.2.3 Toxicogenomics and Nutrigenomics

Definition:

Toxicogenomics and nutrigenomics are collective terms that cover the three sub-disciplines of transcriptomics, proteomics and metabolomics. These profiling techniques can be looked at from a nutritional or toxicological point of view: The term toxicogenomics is used when toxicology is combined with these new methods to better understand and assess the toxic effects of specific compounds, whereas nutrigenomics addresses the impact of specific nutrients or diets on gene expression. It is not to be confused with the term nutrigenetics which investigates how genetic variability influences the body’s response to a nutrient or diet.

State of the Art:

Toxicogenomics has great potential to predict specific toxic effects of drug candidates and chemicals. Toxicogenomics aims to identify biomarker genes and to establish relationships between changes in gene expression patterns and certain toxicological end points. Short term exposure is expected to cause alterations in RNA, protein or metabolite expression patterns that could also help to predict long term effects. In addition, it has already been convincingly shown that these techniques can provide strong evidence regarding toxic mechanisms being activated by the test compounds.

Nutrigenomics has the potential to easily identify hundreds of entities that respond to a given nutrient or non-nutrient, to a treatment or diet in a well defined experimental setting.

Limitations, Gaps in Knowledge and Research Needs:

Toxicogenomic studies and derived classification algorithms are as yet only based on a limited number of compounds. Dose–response relationships have only been established in a very limited number of cases. This could be critical because different mechanisms might be activated by low and high concentrations of one and the same compound. In future it will be important to establish “OMICS” data of a high number of compounds acting by well defined mechanisms. Only in the case that data on a sufficiently high number of compounds belonging to the same compound classes become available, coordinated changes in transcripts, proteins and metabolites could be identified and associated with common molecular (toxic) pathways. Such key pathways and their correlation with biochemical data still have to be identified. Gene, protein and metabolite expression pattern alterations also have to be linked to adverse and beneficial human health effects to increase its as yet limited value for risk assessment. It is essential to establish a harmonized, large-scale, well designed toxicogenomics database with information on gene expression and toxicological parameters that is publicly available.

In order to adequately perform nutritional investigations (nutrigenomic studies), well defined experimental studies with volunteers kept under controlled dietary regimens and in a standardized setting are needed. Furthermore, there is a necessity to standardize the application of the profiling techniques. The current problem is in line with that of toxicogenomics, i. e. the huge datasets generated by nutrigenomics are difficult to interpret adequately. Coordinated changes in transcripts, proteins and metabolites can only be projected on common pathways of regulation in a limited number of cases. Another limitation is that expression profiles vary between different tissues and it often is uncertain which tissue may be relevant. Whereas in animal models tissues may be analyzed quite comprehensively, this is not possible for studies in humans.

2.4 Conclusions and Recommendations

In silico and in vitro techniques for hazard identification as well as in vitro techniques for testing of certain mechanistic end points may facilitate a more efficient safety evaluation of phytochemicals by means of targeted study design. Furthermore, in silico and in vitro investigations may help to reduce the number of animals necessary for efficacy and safety studies. New in vivo techniques may also help to reduce animal numbers and the duration of experiments by predicting “long term” effects such as carcinogenicity based on the results obtained in “short term” studies.

In the opinion of the SKLM the novel approaches are not yet powerful enough to replace the current testing and risk assessment procedures. They are, however, regarded as useful to obtain more comprehensive data and to improve the evaluation of clinical and animal studies or to understand inconsistent data. Furthermore, they might provide mechanistic insights to be included in the risk assessment procedure. However, these novel techniques need a stringent validation, including a comparison with classical methods, in order to ascertain their applicability for a given purpose.

In order to achieve the maximum outcome it is suggested to develop a novel testing strategy by integrating different methodologies into a combined approach. The planning, design and establishment of harmonized, publicly available, high quality, large-scale databases is required to ascertain standardization, comparability and reproducibility and to facilitate cooperation between different laboratories. This will accelerate the validation process and make sure that the new approaches are adequately applied. Experts in bioinformatics are essential to achieve these goals.

It is essential to consider the genetic background of the analyzed population if human studies are performed. A precondition for studying the influence of compounds on metabolite patterns in humans is a comprehensive database on the physiological background situation of individuals and the general population. By doing so, genetic variability can be better taken into account and it might be possible to identify key factors responsible for variability in the study population.