Microscopie E-Book

Encyclopaedia Universalis

• Herausgeber: Encyclopaedia Universalis
• Kategorie: Bildung
• Sprache: Französisch

Seitenzahl: 89

Veröffentlichungsjahr: 2015

Beschreibung

La révolution qui consiste, à la fin du XVIe siècle, à regarder « à la loupe » non plus directement un objet, mais son image agrandie est à l'origine de la microscopie. L'étymologie (du grec mikros, petit, et skopein, examiner) renvoie à l'examen d'objets ou de détails d'objets à peine perceptibles...

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ISBN : 9782341001809

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Microscopie

Introduction

La révolution qui consiste, à la fin du XVIe siècle, à regarder « à la loupe » non plus directement un objet, mais son image agrandie est à l’origine de la microscopie. L’étymologie (du grec mikros, petit, et skopein, examiner) renvoie à l’examen d’objets ou de détails d’objets à peine perceptibles ou invisibles à l’œil nu. La microscopie s’est ensuite progressivement imposée comme une technique d’observation indispensable pour accéder aux propriétés de la matière, inanimée ou vivante.

En introduisant de nouveaux modes d’observation et grâce à une perception de plus en plus fine, jusqu’à l’échelle atomique, la microscopie a ainsi bouleversé notre culture scientifique. Dans le seul domaine de la biologie, les illustrations sont nombreuses : c’est un microscope que Pasteur utilise pour découvrir les micro-organismes de la fermentation et en suivre l’évolution. L’importance de la microscopie optique dans les sciences de la vie à la fin du XIXe siècle s’est encore confirmée au cours du XXe siècle grâce à de nouveaux microscopes. Toujours dans ce domaine, c’est la microscopie électronique qui a permis de progresser rapidement dans l’étude des ultrastructures.

Résolution. Résolution des différents instruments de microscopie.

Le mode de production des images, leurs supports physiques, la nature et le traitement de l’information qu’elles contiennent ont conditionné l’évolution de la microscopie. L’image d’un objet résulte de la saisie d’informations caractéristiques de l’objet (forme, contour, couleur, etc.). Ces informations sont véhiculées par un rayonnement qui interagit avec l’objet. La production d’images par les microscopes traditionnels suppose donc :

– une source de rayonnement et un dispositif d’éclairage de l’objet ;

– une optique de transmission assurant la fonction d’agrandissement,

– un détecteur traduisant l’image sur un support (œil, plaque photographique, écran d’ordinateur pour des images numérisées) ;

L’image obtenue est généralement soumise à l’analyse et à l’interprétation du cerveau.

Par sa nature, le rayonnement détermine l’interaction avec l’objet. On distingue en particulier les objets d’amplitude et les objets de phase selon la caractéristique de l’interaction rayonnement-matière mise en jeu. L’interprétation de l’image fait donc appel à une connaissance précise des interactions rayonnement-matière.

Par sa longueur d’onde, le rayonnement détermine la limite théorique des détails perceptibles sur l’image. Cette limite est imposée par les phénomènes de diffraction (critère de Rayleigh). En outre, la résolution dépend aussi, de façon cruciale, de la construction de l’ensemble qui véhicule l’information depuis l’objet jusqu’au support d’image.

La classification des microscopes traditionnels repose sur la nature du rayonnement. On distingue la microscopie optique (ou photonique), qui utilise les radiations électromagnétiques du spectre visible ou encore les radiations infrarouges ou ultraviolettes proches du visible et même des rayons X, de la microscopie électronique, qui, elle, utilise les propriétés ondulatoires de faisceaux d’électrons accélérés (cf. ONDES - Physique), auxquels peut être associée une courte longueur d’onde ; elle atteint ainsi des résolutions bien meilleures que la microscopie optique.

Dans ces microscopies traditionnelles, les distances séparant la source de rayonnement de l’objet et du détecteur sont grandes par rapport à la longueur d’onde du rayonnement ; on est en régime de propagation ou de champ lointain.

Beaucoup plus récente, la microscopie de champ proche s’est rapidement développée à partir des succès du microscope par effet tunnel dans les années 1980. Ici, l’information est saisie à la source même de sa production. La distance objet-détecteur (souvent quelques distances atomiques ou quelques nanomètres) est faible par rapport à la longueur d’onde du rayonnement, ou par rapport à la portée de l’interaction entre détecteur et objet. La propagation n’intervient donc pas, ce qui élimine les problèmes d’optique de transmission et les limitations de performance qu’ils entraînent. L’image possède donc une résolution exceptionnelle fixée par la taille utile du détecteur.

Enfin, il paraît indispensable de souligner l’importance des échanges continuels entre théorie et expérience afin de comprendre l’évolution historique des techniques de microscopie.

La caractérisation par microscopie est particulièrement adaptée aux sciences expérimentales telles que la physique, la chimie, la pétrologie et la biologie. La démarche du biologiste vise à identifier les relations entre structures et fonctions au sein des organismes vivants. Aux différentes échelles de résolution, la connaissance de la structure est une clé de compréhension des mécanismes qui concourent à une fonction. L’approche méthodologique du biologiste privilégie donc l’étude des composants élémentaires des organismes vivants et celle de leurs interactions. Le physicien cherche, lui, à établir des relations entre la structure et les propriétés physico-chimiques des matériaux. Les images de microscopie entrent ainsi pour beaucoup dans les représentations d’un monde invisible à nos yeux et dans notre compréhension des processus à l’échelle microscopique. Ces approches scientifiques sont de nos jours facilitées par les procédés d’analyse d’images et de reconnaissance de formes. Technique instrumentale au départ, la microscopie se développe sous des formes nouvelles en s’appuyant sur les avancées de la technologie et de la science. En jetant les bases de l’optique électronique, les physiciens ont en effet entièrement conçu le microscope électronique par analogie avec le microscope photonique classique. Les modes d’observation couramment pratiqués en microscopie optique dans le but d’améliorer la détection des détails (fond clair et fond noir) et les modes de correction des aberrations de l’optique (sphéricité, stigmatisme, chromatisme) ont directement inspiré la microscopie électronique. L’excellente résolution du microscope électronique a permis à son tour d’affiner notre connaissance de la matière à l’échelle atomique et d’accéder à des analyses quantitatives d’une extrême précision (micro-analyse). Par la suite, la facilité de construction de sources d’électrons peu étendues et brillantes, ainsi que le balayage de faisceaux d’électrons très focalisés ont permis la naissance de la microscopie électronique à balayage. Cette notion de balayage avec acquisition successive des points de l’image est maintenant transposée à la microscopie photonique, dite microscopie confocale à balayage laser. Cette innovation récente résulte de l’association de techniques de pointe en optique, en micromécanique et en micro-informatique. La microscopie confocale permet d’effectuer des prises de vue tridimensionnelles d’objets épais.

Enfin, à l’échelle atomique, la microscopie ionique de champ, qui a permis de « voir » les atomes pour la première fois, est une utilisation indirecte du phénomène quantique d’effet tunnel. C’est aussi l’effet tunnel que l’on retrouve à la base du fonctionnement d’un microscope à balayage. Son principe, ses performances et sa configuration favorisent le renouveau d’une notion familière à l’optique, celle de champ proche.

Frank SALVAN

Jean DAVOUST

1. Microscopie photonique ou optique

C’est probablement la vision de l’univers lointain et la mise au point des premières lunettes d’astronomie qui ont permis l’invention des premiers microscopes : l’objectif donne une image agrandie de l’objet, et l’oculaire sert, lui, à examiner l’image intermédiaire.

Du point de vue de l’instrumentation, un des avantages de cette configuration est de dissocier les contraintes de fabrication. L’objectif possède une courte distance focale, donc une forte convergence, et un petit diamètre. L’oculaire possède quant à lui une moindre convergence.

Depuis l’invention du premier microscope optique (1690) attribuée au Hollandais Leeuwenhoek et par certains à son prédécesseur, Zacharias Jansen, la microscopie se développe continuellement ; les progrès les plus importants au cours du XXe siècle concernent l’application des phénomènes d’interférence et de contraste de phase, qui rendent possible l’examen d’objets parfaitement transparents, ne différant de leur milieu que par de très petites variations d’épaisseur ou d’indice de réfraction, et la microscopie de fluorescence qui permet de détecter la lumière de fluorescence émise par une préparation biologique convenablement illuminée. Les objets parfaitement transparents examinés en mode de fluorescence sont alors repérés par le rayonnement qu’ils émettent sous l’effet d’un rayonnement excitateur. Ce nouveau mode de contraste, développé au cours des années 1960, permet l’observation de la fluorescence intrinsèque à l’échantillon, ou encore d’anticorps couplés à une molécule fluorescente capable de reconnaître une structure cellulaire ou tissulaire spécifique et de s’y fixer. Il s’agit alors respectivement d’immunocytochimie et d’immunohistochimie.

En complément de la microscopie photonique classique, qui est une microscopie plein champ, c’est-à-dire où l’ensemble de la préparation est totalement éclairé, lamicroscopie confocale, d’origine très récente, procède au balayage d’un point lumineux focalisé pour couvrir la totalité du champ. Ce mode d’observation confocal offre l’avantage d’éliminer totalement la lumière qui ne provient pas du plan de mise au point optique. Les images correspondent alors à des coupes optiques de faible épaisseur (moins de 1 micromètre). Cela permet une reconstruction en trois dimensions d’objets marqués en fluorescence, technique désormais exploitée en science des matériaux et en biologie.

On examinera d’abord les caractéristiques optiques du microscope photonique, qui déterminent la dimension de l’image vis-à-vis de l’objet (grossissement, grandissement), sa luminosité (clarté), ainsi que la largeur et la profondeur de l’espace où l’objet est observable nettement. La qualité deux images sera déterminée par la qualité des optiques, les défauts usuels tels que les aberrations géométriques et chromatiques devant être soigneusement compensés afin d’éviter la distorsion des images ou le flou. On donnera ensuite quelques indications sur la construction des pièces optiques et mécaniques et sur les divers modes d’éclairage possibles (fond clair, fond noir, lumière ultraviolette, lumière polarisée, etc.).

• Caractéristiques des microscopes optiques

Les améliorations successives du système de lentilles et de la partie mécanique du microscope à optique photonique ont fait de celui-ci un instrument de grande précision, robuste et facile à utiliser. Parallèlement à ces améliorations de l’appareil, les techniques de préparation des objets à observer se sont perfectionnées, et l’on a vu le microscope optique devenir un instrument indispensable dans de très nombreux laboratoires, où il est utilisé aussi bien pour des travaux de recherche fondamentale ou appliquée que pour des travaux de simple routine.

Mise au point

Considérons le « microscope réduit » de la figure. L’objectif et l’oculaire sont assimilés respectivement à des lentilles simples L1 et L2. L’objectif fournit d’un objet, tel que AB, une image agrandie A1B1 dont l’oculaire forme l’image (le plus souvent rejetée à l’infini), qui est perçue par l’œil. Elle est renversée, ce qui ne présente pas d’inconvénient.

Microscope visuel. Microscope visuel, l'image B' est à l'infini.

Le diamètre de l’objectif L1 et sa longueur focale f1 sont très petits (de l’ordre de quelques millimètres) ; sa face d’entrée est parfois plongée, de même que l’objet, dans un liquide d’indice de réfraction n> 1 (immersion). L’oculaire a un diamètre et une longueur focale f2 de l’ordre de quelques centimètres. La distance du foyer image F′1 de l’objectif au foyer objet F2