Vergleich von DNA-Aufreinigung mittels Glasmilch und Affinitätssäule E-Book

Maik Lander

• Herausgeber: GRIN Verlag
• Sprache: Deutsch

Veröffentlichungsjahr: 2008

Beschreibung

Studienarbeit aus dem Jahr 2008 im Fachbereich Biologie - Mikrobiologie, Molekularbiologie, Note: offen, Fachhochschule Oldenburg/Ostfriesland/Wilhelmshaven; Standort Emden, Veranstaltung: Molekulare Biotechnologie, Sprache: Deutsch, Abstract: In dieser Studienarbeit sollte versucht werden das Plasmid pBR322 mit Glasmilch aufzureinigen. Um jedoch vorher die Effektivität dieser Methode zu ermitteln, sollte Lambda-DNA mit einer genau bekannten Konzentration aufgereinigt werden. Weiterhin sollte die Methode der Glasmilchaufreinigung mit der Methode der Affinitätssäule verglichen werden. Schon in den 70er Jahren wurden die ersten DNA-Aufreinigungsversuche mit Glasmilch durchgeführt. Sie hat ihre Bedeutung aber größtenteils verloren, als Affinitätssäulen in Kits auf den Markt kamen, welche zwar teuerer sind, aber höhere Ausbeuten und schnellere Durchführung versprechen. Glasmilch ist eine Suspension von Glas in Wasser. Die DNA bindet unter Anwesenheit des Bindungs-Puffers, welcher ein chaotropes Salz (z.B. NaI) enthält, an die Glaspartikel. Danach wird mit einem Waschpuffer, bestehend aus Tris, NaCl und EDTA, gewaschen. Im letzen Schritt kann die DNA mit Wasser oder TE-Puffer eluiert werden. Heutzutage arbeitet man meist mit Silicamembranen anstelle von Glasmilch, was die Handhabung erheblich erleichtert. Auf dem Markt gibt es je nach aufzureinigendem Ausgangsmaterial spezielle Aufreinigungskits, wie z.B. kleine, mittlere oder große Fragmente. Auch der Begriff „Glasmilch“ wird heutzutage nur noch selten verwendet, meist findet man „silica gel based DNA purification“

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung

2 Material und Geräte.

2.2 Chemikalien und Lösungen.

2.3 Geräte

3 Durchführung

3.1 Transformation aus Übernachtkultur Escherichia coli DH5α

3.2 Plasmidisolierung durch Minipräpäration

3.3 Herstellen eigener Glasmilch

3.4 Aufreinigung

3.5 Restriktionsverdau.

3.6 Gelelektrophorese.

3.7 Konzentrationsbestimmung.

4 Ergebnisse

4.1 Transformationseffizienz

4.4 Vergleich von Fermentas- und Brillenglas-Glasmilch.

4.5 Vergleich von Fermentas- und Fensterglas-Glasmilch

4.6 Vergleich der Elutionsmittel und Elutionsmittelmenge

4.8 Aufreinigung mit Affinitätssäulen

4.10 Vergleich der Konzentrationsbestimmungsmethoden

4.10.1 Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar

4.10.2 Gelelektrophorese.

4.10.3 Farbstoff-Wahl

5 Diskussion

5.1 Transformationseffizienz

5.2 Glasmilchaufreinigung

5.2 Affinitätssäulenaufreinigung.

5.3 Vergleich von Glasmilch und Affinitätssäulen

5.4 Vergleich von Hoefer DQ 300 und Fluostar

5.6 Gelelektrophoresen.

6 Ausblick

7 Literatur.

8 Anhang

8.1 Zusammensetzungen von Medien und Lösungen

8.2 Abkürzungen

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Herstellung eigener Glasmilch aus Brillenglas und Fensterglas Vergleich der Ausbeute von gekaufter und selbst hergestellter Glasmilch

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1 Einleitung

In dieser Studienarbeit sollte versucht werden das Plasmid pBR322 mit Glasmilch aufzureinigen. Um jedoch vorher die Effektivität dieser Methode zu ermitteln, sollte Lambda-DNA mit einer genau bekannten Konzentration aufgereinigt werden. Weiterhin sollte die Methode der Glasmilchaufreinigung mit der Methode der Affinitätssäule verglichen werden.

Schon in den 70er Jahren wurden die ersten DNA-Aufreinigungsversuche mit Glasmilch durchgeführt. Sie hat ihre Bedeutung aber größtenteils verloren, als Affinitätssäulen in Kits auf den Markt kamen, welche zwar teuerer sind, aber höhere Ausbeuten und schnellere Durchführung versprechen. Glasmilch ist eine Suspension von Glas in Wasser. Die DNA bindet unter Anwesenheit des Bindungs-Puffers, welcher ein chaotropes Salz (z.B. NaI) enthält, an die Glaspartikel. Danach wird mit einem Waschpuffer, bestehend aus Tris, NaCl und EDTA, gewaschen. Im letzen Schritt kann die DNA mit Wasser oder TE-Puffer eluiert werden. Heutzutage arbeitet man meist mit Silicamembranen anstelle von Glasmilch, was die Handhabung erheblich erleichtert. Auf dem Markt gibt es je nach aufzureinigendem Ausgangsmaterial spezielle Aufreinigungskits, wie z.B. kleine, mittlere oder große Fragmente. Auch der Begriff „Glasmilch“ wird heutzutage nur noch selten verwendet, meist findet man „silica gel based DNA purification“[14].

Danksagung

An dieser Stelle möchten wir uns bei Frau Steffen und Herrn Schmietenknop für die Unterstützung und das Anleiten beim Erlernen neuer Arbeitstechniken bedanken. Nicht zuletzt durch die freundliche und engagierte Betreuung hat uns diese Studienarbeit viel Freude bereitet.

Außerdem gilt unser Dank Herrn Prof. Pfitzner für das Thema und die Unterstützung.

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2 Material und Geräte

2.1 Organismen, Plasmide und EnzymeBakterienstamm:Escherichia coli DH5αPlasmid: pBR322 Plasmid: pUC18 Lambda-DNA (λ-DNA)

Restriktionsenzym: FastDigest™ HindIII (Fermentas) Restriktionsenzym: HindIII (Fermentas) Enzym: Ribonuklease A (kurz: RNase)

2.2 Chemikalien und Lösungen

Zusammensetzungen und Konzentrationen im Anhang

Transformation

LB-Medium (fest) LB-Medium (flüssig) LBC-Medium (fest) CaCl250 mM

Minipräperation

TE-Puffer GTE-Lösung (Glucose/Tris/EDTA) SDS/NaOH-Lösung KOAc-Lösung Isopropanol Ethanol

Bestimmung der DNA-Konzentration durch Fluoreszensmessung 10x TNE Puffer Hoechst 33258 dye stock Lösung Low Range Assay Lösung PicoGreen Farbstoff