Analytische Biochemie - Ulla Wollenberger - E-Book

Analytische Biochemie E-Book

Ulla Wollenberger

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Beschreibung

Zur Lösung analytischer Fragestellungen wird in der Biotechnologie, der Lebensmittel- und Umweltanalytik sowie der klinischen und pharmazeutischen Chemie neben der instrumentellen Analytik immer häufiger auf bioanalytische Methoden zurückgegriffen. Diese beruhen z. B. auf dem Einsatz von Enzymen, Nukleinsäuren oder Antikörpern. Dazu bietet das Buch eine praktische Einführung in die qualitative und quantitative Analytik mit biochemischen Reagenzien, die sowohl für das Studium wie für die Weiterbildung im Beruf geeignet ist. Die Autoren schlagen eine Brücke von den theoretischen Grundlagen hin zu den praktischen Anwendungen. Dem vertieften Verständnis dient die Beschreibung erprobter Praktikumsversuche. Die Autoren gehören zu einer der weltweit führenden Forschungsgruppen auf diesem Gebiet, lassen aber auch ihre langjährige Lehrerfahrung in dieses neue Buch einfließen.

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Seitenzahl: 251

Veröffentlichungsjahr: 2012

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Contents

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About the Author

Copyright

Vorwort

Verzeichnis

Part I

1 Biomolekulare Erkennung

1.1 Biomolekulare Erkennung und Bioanalytik

1.2 Anwendungsgebiete der Bioanalytik

2 Methoden der Analytik mit Enzymen

2.1 Grundlagen

2.2 Nachweisreaktionen

3 Antikörper in der Analytischen Biochemie

3.1 Immunochemische Grundlagen

3.2 Immunochemische Bestimmungsmethoden

4 Nukleinsäuren

4.1 Die Natur der Nukleinsäuren

4.2 Analytik von Nukleinsäuren

4.3 Molekulare Grundlage der Nukleinsäureerkennung

4.4 Die Polymerase-Kettenreaktion

4.5 Nukleinsäure-Chips

5 Immobilisierung der Biokomponenten

5.1 Einführung

5.2 Physikalische Immobilisierungsverfahren

6 Analysensysteme mit immobilisierten Biomolekülen

6.1 Einführung

6.2 Teststreifen

6.3 Biosensoren

6.4 DNA-Chip-Technologie

6.5 Miniaturisierte Analysensysteme

6.6 Nanobiotechnologie

7 Weiterführende Literatur

Part II

P1 Bestimmung von Glucose und Stärke in Lebensmittelproben mit immobilisierten Enzymen

Pl.l Aufgabenstellung

Pl.2 Grundlagen

P1.3 Durchführung

P1.4 Reagenzien und Geräte

P1.5 Literatur

P2 Bestimmung von L-Malat in einer Lebensmittelprobe mit gekoppelten Enzymreaktionen nach zwei Verfahren: Biosensor und photometrischer Test

P2.1 Aufgabenstellung

P2.2 Grundlagen

P2.3 Durchführung

P2.4 Geräte und Reagenzien

P3 Messung von Peroxidase aus Meerrettich und Bestimmung der kinetischen Konstanten

P3.1 Aufgabenstellung

P3.2 Grundlagen

P3.3 Durchführung

P3.3.1 Bestimmung des Absorptionsmaximums des Reaktionsproduktes

P3.4 Geräte und Reagenzien

P4 Messung von Inhibitoren der Acetylcholinesterase und Charakterisierung der Hemmung

P4.1 Aufgabenstellung

P4.2 Grundlagen

P4.3 Durchführung

P4.4 Reagenzien und Geräte

P5

P5.1 Aufgabenstellung

P5.2 Grundlagen

P5.3 Durchführung

P5.4 Reagenzien und Geräte

P5.5 Literatur

P6 Experimente zur Nukleinsäureanalytik

P6.1 Aufgabenstellung

P6.2 Grundlagen

P6.3 Durchführung

P6.4 Reagenzien und Geräte

P6.5 Weiterführende Literatur

P7 Kompetitiver Enzymimmunoassay für 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure mit optischer Detektion

P7.1 Aufgabenstellung

P7.2 Grundlagen

P7.3 Durchführung

P7.4 Reagenzien und Geräte

P7.5 Literaturhinweise

P8 Qualitativer und quantitativer Nachweis von IgG mit Sandwich-ELISA im Immunodot-Blot-Test und Mikrotiterplatten-Format

P8.1 Aufgabenstellung

P8.2 Grundlagen

P8.3 Durchführung

P8.4 Reagenzien und Geräte

P8.5 Weiterführende Literatur

P9 Markierungsfreie Messung der Wechselwirkung von IgG und Protein A mit optischem Biosensor (SPR)

P9.1 Aufgabenstellung

P9.2 Grundlagen

P9.3 Durchführung

P9.4 Durchführung

P9.5 Durchführung

Index

Weiterführende Literatur zur Analytik und Biotechnologie

Rolf D. Schmid

Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik

352 Seiten, 2001

ISBN 3-527-30865-X

Matthias Otto

Ananlytische Chemie

694 Seiten, 2000

ISBN 3-527-29840-1

Wolfgang Gottwald

Statistik für Anwender

236 Seiten, 1999

ISBN 3-527-29780-4

Dr. Ulla Wollenberger

Institut für Biochemie und Biologie

Analytische Biochemie

Universität Potsdam

Karl-Liebknecht-Str. 24–25, Haus 25

14476 Golm

E-Mail: [email protected]

Prof. Dr. Reinhard Renneberg

Hong Kong University of Science and Technology

Department of Chemistry

Clear Water Bay, Kowloon

SAR Hong Kong

PR China

E-Mail: [email protected]

Prof. Dr. Frank F. Bier

Fraunhofer Institut

Biomedizinische Technik

Abt. Molekulare Bioanalytik und Bioelektronik

A.-Scheunert-Allee 114–116

14558 Bergholz-Rehbrücke

E-Mail: [email protected]

Prof. Dr. FriederW. Scheller

Institut für Biochemie und Biologie

Analytische Biochemie

Universität Potsdam

Karl-Liebknecht-Straße 24–25, Haus 25

14476 Golm

E-Mail: [email protected]

Das vorliegende Werk wurde sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autor und Verlag für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler keine Haftung.

BibliografischeInformation Der Deutschen Bibliothek

Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über <http://dnb.ddb.de> abrufbar.

© 2003 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

Alle Rechte, insbesondere die der Übersetzung in andere Sprachen, vorbehalten. Kein Teil dieses Buches darf ohne schriftliche Genehmigung des Verlages in irgendeiner Form – durch Fotokopie, Mikroverfilmung oder irgendein anderes Verfahren – reproduziert oder in eine von Maschinen, insbesondere von Datenverarbeitungsmaschinen, verwendbare Sprache übertragen oder übersetzt werden. Die Wiedergabe von Warenbezeichnungen, Handelsnamen oder sonstigen Kennzeichen in diesem Buch berechtigt nicht zu der Annahme, dass diese von jedermann frei benutzt werden dürfen. Vielmehr kann es sich auch dann um eingetragene Warenzeichen oder sonstige gesetzlich geschützte Kennzeichen handeln, wenn sie nicht eigens als solche markiert sind.

Printed in the Federal Republic of Germany Gedruckt auf säurefreiem Papier.

Satz K+V Fotosatz GmbH, Beerfelden

Druck betz-druck GmbH, Darmstadt

Bindung Litges & Dopf Buchbinderei GmbH, Heppenheim

Print ISBN 9783527301669

Epdf ISBN 9783527663637

Epub ISBN 9783527663620

Mobi ISBN 9783527663613

Vorwort

Analytische Untersuchungsmethoden gehören zum Handwerkszeug aller experimentellen Naturwissenschaftler. Für die Biowissenschaften hat sich ein eigenständiger Wissenschaftszweig, die Bioanalytik, herausgebildet. Er beinhaltet auf der einen Seite die Anwendung physiko-chemischer Methoden zur Charakterisierung biologischer Systeme auf unterschiedlichem Integrationsniveau, auf der anderen Seite den Einsatz biochemischer Reagenzien (Specifier) zur Erkennung von Zielmolekülen. Methodische Fortschritte haben viele wichtige Erkenntnisdurchbrüche in den Biowissenschaften erst erlaubt, z. B. die Aufklärung des menschlichen Genoms durch die automatisierte DNA-Sequenzierung in den letzten Jahren. Die darauf aufbauenden Konzepte der ganzheitlichen Beschreibung biologischer Systeme auf den Ebenen der Genomik, der Proteomik und der Metabolomik erfordern wiederum neuartige Analysenmethoden mit Hochdurchsatz und streben eine räumlich und zeitlich aufgelöste Widerspiegelung an.

Dieses Gebiet ist in dem Buch „Bioanalytik“ von F. Lottspeich und H. Zorbas umfassend und systematisch dargestellt.

Die Verwendung von Biomolekülen als Werkzeuge in der Analytik ist Gegenstand des vorliegenden Buches. Die Biomoleküle dienen dabei auf der einen Seite zum „Messen“ anderer Biomoleküle, z. B. werden Antikörper zum Nachweis von Protein-Antigen und Nukleinsäuren bei der Hybridisierung zur Bindung einer komplementären Nukleinsäure eingesetzt. Diese Anwendungen kommen vor allem in der biomedizinischen Forschung und in der klinischen Diagnostik vor. Dabei erfolgt eine fruchtbare Wechselwirkung zwischen methodischer Entwicklung und problemorientierten Biowissenschaften, die auf eine Verbesserung der funktionellen Eigenschaften der biochemischen Werkzeuge zielt.

Auf der anderen Seite werden Biomoleküle in unterschiedlichen Gebieten von Wirtschaft und Umwelt eingesetzt und zur Analyse von „nichtbiologischen“ Substanzen herangezogen. Die Nutzung von Biomolekülen in der Analytik steht immer in Konkurrenz zu physiko-chemischen Methoden und die Entscheidung über die optimale Methode hängt von den jeweiligen Anforderungen ab.

Analytische Methoden unter Nutzung von Biomolekülen in der biochemischen Forschung und in der Routineanalytik sind Gegenstand der Ausbildung von Biochemikern, Biotechnologen und Ernährungswissenschaftlern, aber auch von Medizinern und Chemikern. Wegen des breiten Spektrums von Disziplinen führt das vorliegende Buch zunächst in die Anwendungsgebiete ein, um die Relevanz für den Leser darzulegen. Danach erfolgt die grundlegende Darstellung der unterschiedlichen Biomoleküle in Hinblick auf ihre Anwendung als Erkennungselemente in der Analytik. Nachfolgend werden die Konzepte für Messsysteme mit Biomolekülen vorgestellt. Die experimentelle Realisierung dieser Messsysteme wird im zweiten Teil anhand von komplexen Praktikumsversuchen erläutert. Neben bereits etablierten Methoden, wie die Bestimmung der Enzymaktivität, der enzymatischen Substratbestimmung und dem Enzym-Immunoassay, werden die Nutzung optischer Sensoren zur Analyse biospezifischer Wechselwirkung sowie die Herstellung und Erprobung von Enzym-Teststreifen, von Enzymelektroden und von DNA-Chips beschrieben.

Die vorgestellten Versuche basieren auf Vorschriften, die unter Beteiligung der Mitarbeiter des Lehrstuhls Analytische Biochemie der Universität Potsdam und der Abteilung Molekulare Bioanalytik und Bioelektronik des Fraunhofer Instituts für Biomedizintechnik für die Praktika des Diplomstudiengangs Biochemie an der Universität Potsdam ausgearbeitet wurden. Dafür möchten wir uns bei allen Kollegen bedanken. Besonders hervorheben möchten wir Eva Ehrentreich-Förster, Nenad Gajovic-Eichelmann, Christian Heise, Andrea Kühn, Angelika Lehmann, Fred Lisdat, Alexander Makower, Susanne Schwonbeck, Walter Stöcklein und Axel Warsinke. Unser besonderer Dank gilt Dieter Kirstein, dessen Vorlesungsunterlagen in den Abschnitt Immobilisierung einflossen. Edith Micheel und Karin Tiepner danken wir für die technische Hilfe. Viele Abbildungen sind von Sibylle Ripcke gezeichnet worden, dafür unser besonderer Dank.

An dieser Stelle wollen wir auch dem Verlag Wiley-VCH danken, der trotz der Widrigkeiten mehrerer Umzüge uns ermutigt hat, das Buch fertigzustellen.

Potsdam, Juni 2003

Frieder Scheller

Ulla Wollenberger

Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen

ABTS

2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz

AchE

Acetylcholinesterase

Ag

Antigen

AIDS

Acquired immune deficiency syndrome

Ak

Antikörper

AP

Alkalische Phosphatase

APTES

Aminopropyltriethoxysilan

ATP

Adenosintriphosphat

BIA

Biospecific interaction analysis

BSA

Bovine serum albumin, Rinderserumalbumin

BSE

Bovine Spongiforme Encephalopathie

cDNA

Complementary (copy) DNA

CK

Creatinkinase

CV

Cyclisches Voltammogramm

Cyt c

Cytochrom c

2,4-D

2,4-Dichlorphenoxyessigsäure

ddNTP

Didesoxyribonukleosidtriphosphat

DFP

Diisopropylfluorophosphat

DMF

Dimethylformamid

DNA

Desoxyribonukleinsäure

dNTP

Desoxyribonukleosidtriphosphat

dsDNA

Double-stranded DNA, Doppelstrang-DNA

DTNB

5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure, Ellman-Reagenz

EDC

N' -(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid

EDTA

Ethylendiamintetraacetat

EIA

Enzymimmunoassay

ELISA

Enzyme linked Immunosorbent Assay

FIA

Fließinjektionsanalyse-System

FIA

Fluoreszenzimmunoassay

FISH

Fluorescence-in situ hybridization

GOD

Glucoseoxidase

GOT

Glutamat-Oxalacetat-Transaminase

GPT

Glutamat-Pyruvat-Transaminase

HEMA

Hydroxyethylmethacrylat

HEPES

N-2-2-Hydroxyethyl-l-piperazin-N'-2-ethanolsulfonsäure

HK

Hexokinase

HPLC

High performance liquid Chromatographie

HRP

Horse-radish peroxidase, Meerrettichperoxidase

IgG

Immunooglobulin G

IP

Isoelektrischer Punkt

IUPAC

International Union of Pure and Applied Chemistry

KHLP

Key hole lymphet protein

LDH

Lactatdehydrogenase

LED

Light emitting diode, Licht emittierende Diode

LOD

Limit of detection

LOD

Lactatoxidase

MAb

monoklonaler Antikörper

MDH

Malatdehydrogenase

MUA

Mercaptoundekansäure

NAD

Nicotinamid-adenin-dinukleotid

NADP

Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat

NHS

N-Hydroxy-Succinimid

NMM

N-Methyl-Morpholin

p-NP

p-Nitrophenol

p-NPP

p-Nitrophenylphosphat

O.D.

Optische Dichte unter Standardbedingungen

PAb

polyklonaler Antikörper

PCR

Polymerase-Kettenreaktion

PK

Pyruvatkinase

POD

Peroxidase

POP

Pyruvatoxidase

PVA

Polyvinylalkohol

RFLP

Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus

RI

Bulk refractive index effect, Indexsprung

RIA

Radioimmunoassay

RNA

Ribonukleinsäure

ROS

Reaktive Sauerstoffspezies

RU

Resonance Unit, Resonanzwinkel-Änderung

SAM

Selbstanordnende Monoschicht

SDS

Natriumdodecylsulfat

SNP

Single nucleotide polymorphism

SPR

Surface plasmon resonance, Oberflächenplasmonresonanz

ssDNA

Single-stranded DNA, Einzelstrang-DNA

μTAS

Micro Total Analytical Systems

TEMED

N,N,N',N'-Tetramethylendiamin

TNT

Trinitrotoluol

TNTU

2-(5-Norbornen-2,3-dicarboximido)-l,l,3,3-tetramethyluronium tetrafluorborat U International unit (IU)

TRIS

Tris(hydroxymethyl)aminomethan

WHO

World Health Organization

XOD

Xanthinoxidase

Part I

Grundprinzipien der Analytik mit biochemischen Reagenzien

1

Biomolekulare Erkennung

1.1 Biomolekulare Erkennung und Bioanalytik

Lebewesen stehen durch ihre Sinnesorgane in Wechselwirkung mit der Umwelt und können damit auf Veränderungen reagieren. Diese Sinnesorgane zeichnen sich durch eine hohe Empfindlichkeit, die Fähigkeit der Wahrnehmung kleiner Änderungen des Signalpegels und oft eine hohe chemische Selektivität aus.

Bei der Signalerfassung erfolgt eine enge Wechselwirkung des Signals mit einer sensitiven Struktur, die sich auf komplex aufgebauten Biomakromolekülen befindet. In der Regel tritt ein begrenzter Abschnitt mit dem „chemischen Signal“ (Reaktionspartner) in Wechselwirkung. Dieses Reaktionsareal besitzt eine spezifische räumliche Anordnung, sodass sich passfähige Moleküle mit hoher Affinität binden können. Solche selektiv reagierenden Gebiete in molekularen und supramolekularen biologischen Strukturen werden als Rezeptoren (Rezeptorareale, Bindungsstellen) bezeichnet. Einfach gebaute Substanzen mit einem niedrigen Molekulargewicht werden relativ unspezifisch gebunden, während bei organischen Stoffen mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen die Bindung an den Rezeptor bereits mit hoher Spezifität erfolgt. Die Größe der Rezeptorareale, z. B. von Acetylcholin, Noradrenalin oder Dopamin, liegt in der Größenordnung von 10 nm.

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