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Zur Lösung analytischer Fragestellungen wird in der Biotechnologie, der Lebensmittel- und Umweltanalytik sowie der klinischen und pharmazeutischen Chemie neben der instrumentellen Analytik immer häufiger auf bioanalytische Methoden zurückgegriffen. Diese beruhen z. B. auf dem Einsatz von Enzymen, Nukleinsäuren oder Antikörpern. Dazu bietet das Buch eine praktische Einführung in die qualitative und quantitative Analytik mit biochemischen Reagenzien, die sowohl für das Studium wie für die Weiterbildung im Beruf geeignet ist. Die Autoren schlagen eine Brücke von den theoretischen Grundlagen hin zu den praktischen Anwendungen. Dem vertieften Verständnis dient die Beschreibung erprobter Praktikumsversuche. Die Autoren gehören zu einer der weltweit führenden Forschungsgruppen auf diesem Gebiet, lassen aber auch ihre langjährige Lehrerfahrung in dieses neue Buch einfließen.
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Seitenzahl: 251
Veröffentlichungsjahr: 2012
Contents
Series
About the Author
Copyright
Vorwort
Verzeichnis
Part I
1 Biomolekulare Erkennung
1.1 Biomolekulare Erkennung und Bioanalytik
1.2 Anwendungsgebiete der Bioanalytik
2 Methoden der Analytik mit Enzymen
2.1 Grundlagen
2.2 Nachweisreaktionen
3 Antikörper in der Analytischen Biochemie
3.1 Immunochemische Grundlagen
3.2 Immunochemische Bestimmungsmethoden
4 Nukleinsäuren
4.1 Die Natur der Nukleinsäuren
4.2 Analytik von Nukleinsäuren
4.3 Molekulare Grundlage der Nukleinsäureerkennung
4.4 Die Polymerase-Kettenreaktion
4.5 Nukleinsäure-Chips
5 Immobilisierung der Biokomponenten
5.1 Einführung
5.2 Physikalische Immobilisierungsverfahren
6 Analysensysteme mit immobilisierten Biomolekülen
6.1 Einführung
6.2 Teststreifen
6.3 Biosensoren
6.4 DNA-Chip-Technologie
6.5 Miniaturisierte Analysensysteme
6.6 Nanobiotechnologie
7 Weiterführende Literatur
Part II
P1 Bestimmung von Glucose und Stärke in Lebensmittelproben mit immobilisierten Enzymen
Pl.l Aufgabenstellung
Pl.2 Grundlagen
P1.3 Durchführung
P1.4 Reagenzien und Geräte
P1.5 Literatur
P2 Bestimmung von L-Malat in einer Lebensmittelprobe mit gekoppelten Enzymreaktionen nach zwei Verfahren: Biosensor und photometrischer Test
P2.1 Aufgabenstellung
P2.2 Grundlagen
P2.3 Durchführung
P2.4 Geräte und Reagenzien
P3 Messung von Peroxidase aus Meerrettich und Bestimmung der kinetischen Konstanten
P3.1 Aufgabenstellung
P3.2 Grundlagen
P3.3 Durchführung
P3.3.1 Bestimmung des Absorptionsmaximums des Reaktionsproduktes
P3.4 Geräte und Reagenzien
P4 Messung von Inhibitoren der Acetylcholinesterase und Charakterisierung der Hemmung
P4.1 Aufgabenstellung
P4.2 Grundlagen
P4.3 Durchführung
P4.4 Reagenzien und Geräte
P5
P5.1 Aufgabenstellung
P5.2 Grundlagen
P5.3 Durchführung
P5.4 Reagenzien und Geräte
P5.5 Literatur
P6 Experimente zur Nukleinsäureanalytik
P6.1 Aufgabenstellung
P6.2 Grundlagen
P6.3 Durchführung
P6.4 Reagenzien und Geräte
P6.5 Weiterführende Literatur
P7 Kompetitiver Enzymimmunoassay für 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure mit optischer Detektion
P7.1 Aufgabenstellung
P7.2 Grundlagen
P7.3 Durchführung
P7.4 Reagenzien und Geräte
P7.5 Literaturhinweise
P8 Qualitativer und quantitativer Nachweis von IgG mit Sandwich-ELISA im Immunodot-Blot-Test und Mikrotiterplatten-Format
P8.1 Aufgabenstellung
P8.2 Grundlagen
P8.3 Durchführung
P8.4 Reagenzien und Geräte
P8.5 Weiterführende Literatur
P9 Markierungsfreie Messung der Wechselwirkung von IgG und Protein A mit optischem Biosensor (SPR)
P9.1 Aufgabenstellung
P9.2 Grundlagen
P9.3 Durchführung
P9.4 Durchführung
P9.5 Durchführung
Index
Weiterführende Literatur zur Analytik und Biotechnologie
Rolf D. Schmid
Taschenatlas der Biotechnologie und Gentechnik
352 Seiten, 2001
ISBN 3-527-30865-X
Matthias Otto
Ananlytische Chemie
694 Seiten, 2000
ISBN 3-527-29840-1
Wolfgang Gottwald
Statistik für Anwender
236 Seiten, 1999
ISBN 3-527-29780-4
Dr. Ulla Wollenberger
Institut für Biochemie und Biologie
Analytische Biochemie
Universität Potsdam
Karl-Liebknecht-Str. 24–25, Haus 25
14476 Golm
E-Mail: [email protected]
Prof. Dr. Reinhard Renneberg
Hong Kong University of Science and Technology
Department of Chemistry
Clear Water Bay, Kowloon
SAR Hong Kong
PR China
E-Mail: [email protected]
Prof. Dr. Frank F. Bier
Fraunhofer Institut
Biomedizinische Technik
Abt. Molekulare Bioanalytik und Bioelektronik
A.-Scheunert-Allee 114–116
14558 Bergholz-Rehbrücke
E-Mail: [email protected]
Prof. Dr. FriederW. Scheller
Institut für Biochemie und Biologie
Analytische Biochemie
Universität Potsdam
Karl-Liebknecht-Straße 24–25, Haus 25
14476 Golm
E-Mail: [email protected]
Das vorliegende Werk wurde sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autor und Verlag für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler keine Haftung.
BibliografischeInformation Der Deutschen Bibliothek
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© 2003 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim
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Printed in the Federal Republic of Germany Gedruckt auf säurefreiem Papier.
Satz K+V Fotosatz GmbH, Beerfelden
Druck betz-druck GmbH, Darmstadt
Bindung Litges & Dopf Buchbinderei GmbH, Heppenheim
Print ISBN 9783527301669
Epdf ISBN 9783527663637
Epub ISBN 9783527663620
Mobi ISBN 9783527663613
Vorwort
Analytische Untersuchungsmethoden gehören zum Handwerkszeug aller experimentellen Naturwissenschaftler. Für die Biowissenschaften hat sich ein eigenständiger Wissenschaftszweig, die Bioanalytik, herausgebildet. Er beinhaltet auf der einen Seite die Anwendung physiko-chemischer Methoden zur Charakterisierung biologischer Systeme auf unterschiedlichem Integrationsniveau, auf der anderen Seite den Einsatz biochemischer Reagenzien (Specifier) zur Erkennung von Zielmolekülen. Methodische Fortschritte haben viele wichtige Erkenntnisdurchbrüche in den Biowissenschaften erst erlaubt, z. B. die Aufklärung des menschlichen Genoms durch die automatisierte DNA-Sequenzierung in den letzten Jahren. Die darauf aufbauenden Konzepte der ganzheitlichen Beschreibung biologischer Systeme auf den Ebenen der Genomik, der Proteomik und der Metabolomik erfordern wiederum neuartige Analysenmethoden mit Hochdurchsatz und streben eine räumlich und zeitlich aufgelöste Widerspiegelung an.
Dieses Gebiet ist in dem Buch „Bioanalytik“ von F. Lottspeich und H. Zorbas umfassend und systematisch dargestellt.
Die Verwendung von Biomolekülen als Werkzeuge in der Analytik ist Gegenstand des vorliegenden Buches. Die Biomoleküle dienen dabei auf der einen Seite zum „Messen“ anderer Biomoleküle, z. B. werden Antikörper zum Nachweis von Protein-Antigen und Nukleinsäuren bei der Hybridisierung zur Bindung einer komplementären Nukleinsäure eingesetzt. Diese Anwendungen kommen vor allem in der biomedizinischen Forschung und in der klinischen Diagnostik vor. Dabei erfolgt eine fruchtbare Wechselwirkung zwischen methodischer Entwicklung und problemorientierten Biowissenschaften, die auf eine Verbesserung der funktionellen Eigenschaften der biochemischen Werkzeuge zielt.
Auf der anderen Seite werden Biomoleküle in unterschiedlichen Gebieten von Wirtschaft und Umwelt eingesetzt und zur Analyse von „nichtbiologischen“ Substanzen herangezogen. Die Nutzung von Biomolekülen in der Analytik steht immer in Konkurrenz zu physiko-chemischen Methoden und die Entscheidung über die optimale Methode hängt von den jeweiligen Anforderungen ab.
Analytische Methoden unter Nutzung von Biomolekülen in der biochemischen Forschung und in der Routineanalytik sind Gegenstand der Ausbildung von Biochemikern, Biotechnologen und Ernährungswissenschaftlern, aber auch von Medizinern und Chemikern. Wegen des breiten Spektrums von Disziplinen führt das vorliegende Buch zunächst in die Anwendungsgebiete ein, um die Relevanz für den Leser darzulegen. Danach erfolgt die grundlegende Darstellung der unterschiedlichen Biomoleküle in Hinblick auf ihre Anwendung als Erkennungselemente in der Analytik. Nachfolgend werden die Konzepte für Messsysteme mit Biomolekülen vorgestellt. Die experimentelle Realisierung dieser Messsysteme wird im zweiten Teil anhand von komplexen Praktikumsversuchen erläutert. Neben bereits etablierten Methoden, wie die Bestimmung der Enzymaktivität, der enzymatischen Substratbestimmung und dem Enzym-Immunoassay, werden die Nutzung optischer Sensoren zur Analyse biospezifischer Wechselwirkung sowie die Herstellung und Erprobung von Enzym-Teststreifen, von Enzymelektroden und von DNA-Chips beschrieben.
Die vorgestellten Versuche basieren auf Vorschriften, die unter Beteiligung der Mitarbeiter des Lehrstuhls Analytische Biochemie der Universität Potsdam und der Abteilung Molekulare Bioanalytik und Bioelektronik des Fraunhofer Instituts für Biomedizintechnik für die Praktika des Diplomstudiengangs Biochemie an der Universität Potsdam ausgearbeitet wurden. Dafür möchten wir uns bei allen Kollegen bedanken. Besonders hervorheben möchten wir Eva Ehrentreich-Förster, Nenad Gajovic-Eichelmann, Christian Heise, Andrea Kühn, Angelika Lehmann, Fred Lisdat, Alexander Makower, Susanne Schwonbeck, Walter Stöcklein und Axel Warsinke. Unser besonderer Dank gilt Dieter Kirstein, dessen Vorlesungsunterlagen in den Abschnitt Immobilisierung einflossen. Edith Micheel und Karin Tiepner danken wir für die technische Hilfe. Viele Abbildungen sind von Sibylle Ripcke gezeichnet worden, dafür unser besonderer Dank.
An dieser Stelle wollen wir auch dem Verlag Wiley-VCH danken, der trotz der Widrigkeiten mehrerer Umzüge uns ermutigt hat, das Buch fertigzustellen.
Potsdam, Juni 2003
Frieder Scheller
Ulla Wollenberger
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
ABTS
2,2'-Azino-bis-(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure)-Diammoniumsalz
AchE
Acetylcholinesterase
Ag
Antigen
AIDS
Acquired immune deficiency syndrome
Ak
Antikörper
AP
Alkalische Phosphatase
APTES
Aminopropyltriethoxysilan
ATP
Adenosintriphosphat
BIA
Biospecific interaction analysis
BSA
Bovine serum albumin, Rinderserumalbumin
BSE
Bovine Spongiforme Encephalopathie
cDNA
Complementary (copy) DNA
CK
Creatinkinase
CV
Cyclisches Voltammogramm
Cyt c
Cytochrom c
2,4-D
2,4-Dichlorphenoxyessigsäure
ddNTP
Didesoxyribonukleosidtriphosphat
DFP
Diisopropylfluorophosphat
DMF
Dimethylformamid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleosidtriphosphat
dsDNA
Double-stranded DNA, Doppelstrang-DNA
DTNB
5,5'-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure, Ellman-Reagenz
EDC
N' -(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EIA
Enzymimmunoassay
ELISA
Enzyme linked Immunosorbent Assay
FIA
Fließinjektionsanalyse-System
FIA
Fluoreszenzimmunoassay
FISH
Fluorescence-in situ hybridization
GOD
Glucoseoxidase
GOT
Glutamat-Oxalacetat-Transaminase
GPT
Glutamat-Pyruvat-Transaminase
HEMA
Hydroxyethylmethacrylat
HEPES
N-2-2-Hydroxyethyl-l-piperazin-N'-2-ethanolsulfonsäure
HK
Hexokinase
HPLC
High performance liquid Chromatographie
HRP
Horse-radish peroxidase, Meerrettichperoxidase
IgG
Immunooglobulin G
IP
Isoelektrischer Punkt
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
KHLP
Key hole lymphet protein
LDH
Lactatdehydrogenase
LED
Light emitting diode, Licht emittierende Diode
LOD
Limit of detection
LOD
Lactatoxidase
MAb
monoklonaler Antikörper
MDH
Malatdehydrogenase
MUA
Mercaptoundekansäure
NAD
Nicotinamid-adenin-dinukleotid
NADP
Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat
NHS
N-Hydroxy-Succinimid
NMM
N-Methyl-Morpholin
p-NP
p-Nitrophenol
p-NPP
p-Nitrophenylphosphat
O.D.
Optische Dichte unter Standardbedingungen
PAb
polyklonaler Antikörper
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PK
Pyruvatkinase
POD
Peroxidase
POP
Pyruvatoxidase
PVA
Polyvinylalkohol
RFLP
Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus
RI
Bulk refractive index effect, Indexsprung
RIA
Radioimmunoassay
RNA
Ribonukleinsäure
ROS
Reaktive Sauerstoffspezies
RU
Resonance Unit, Resonanzwinkel-Änderung
SAM
Selbstanordnende Monoschicht
SDS
Natriumdodecylsulfat
SNP
Single nucleotide polymorphism
SPR
Surface plasmon resonance, Oberflächenplasmonresonanz
ssDNA
Single-stranded DNA, Einzelstrang-DNA
μTAS
Micro Total Analytical Systems
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylendiamin
TNT
Trinitrotoluol
TNTU
2-(5-Norbornen-2,3-dicarboximido)-l,l,3,3-tetramethyluronium tetrafluorborat U International unit (IU)
TRIS
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
WHO
World Health Organization
XOD
Xanthinoxidase
Lebewesen stehen durch ihre Sinnesorgane in Wechselwirkung mit der Umwelt und können damit auf Veränderungen reagieren. Diese Sinnesorgane zeichnen sich durch eine hohe Empfindlichkeit, die Fähigkeit der Wahrnehmung kleiner Änderungen des Signalpegels und oft eine hohe chemische Selektivität aus.
Bei der Signalerfassung erfolgt eine enge Wechselwirkung des Signals mit einer sensitiven Struktur, die sich auf komplex aufgebauten Biomakromolekülen befindet. In der Regel tritt ein begrenzter Abschnitt mit dem „chemischen Signal“ (Reaktionspartner) in Wechselwirkung. Dieses Reaktionsareal besitzt eine spezifische räumliche Anordnung, sodass sich passfähige Moleküle mit hoher Affinität binden können. Solche selektiv reagierenden Gebiete in molekularen und supramolekularen biologischen Strukturen werden als Rezeptoren (Rezeptorareale, Bindungsstellen) bezeichnet. Einfach gebaute Substanzen mit einem niedrigen Molekulargewicht werden relativ unspezifisch gebunden, während bei organischen Stoffen mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen die Bindung an den Rezeptor bereits mit hoher Spezifität erfolgt. Die Größe der Rezeptorareale, z. B. von Acetylcholin, Noradrenalin oder Dopamin, liegt in der Größenordnung von 10 nm.
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