Elektrophorese leicht gemacht E-Book

Reiner Westermeier

• Herausgeber: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
• Kategorie: Wissenschaft und neue Technologien
• Sprache: Deutsch

Seitenzahl: 576

Veröffentlichungsjahr: 2016

Beschreibung

Die zweite Auflage eines Standardwerks: Alle wichtigen Aspekte und Techniken der Elektrophorese werden abgedeckt, von SDS-PAGE und Isotachophorese bis zu isoelektrischer Fokussierung, blauer Nativ-Elektrophorese und zweidimensionalen Methoden. Speziell auf die Bedürfnisse von Laboranten und technischen Angestellten zugeschnitten, stehen praktische Gesichtspunkte und Methoden im Mittelpunkt des Buchs. Nach einem Überblick über alle gängigen Elektrophoresetechniken mit einer Einführung in Detektion, Musterauswertung und Proteomik folgen Kapitel zu Instrumentierung und benötigten Arbeitsmaterialien. Detaillierte Methodenanleitungen erleichtern auch dem Anfänger den praktischen Einstieg in die Welt der Elektrophorese. Die Begleitwebsite mit zahlreichen Animationen ermöglicht einen zusätzlichen visuellen Zugang zu den einzelnen Techniken.

Leseprobe

Inhaltsverzeichnis

Cover

Titelseite

Autor

Impressum

Geleitwort

Vorwort

Vorwort zur ersten Auflage

Abkürzungen

Teil I: Grundlagen

1 Elektrophorese

1.1 Allgemeines

1.2 Elektrophoresen in nicht restriktiven Gelen

1.3 Elektrophorese in restriktiven Gelen

2 Isotachophorese

2.1 Wanderung mit gleicher Geschwindigkeit

2.2 Trennung der Substanzen in der Form einer Kette

ion train

2.3 Zonenschärfungseffekt

2.4 Konzentrationsregulierungseffekt

3 Isoelektrische Fokussierung

3.1 Prinzip

3.2 Gele für die IEF

3.3 Temperatur

3.4 Kontrolle des pH-Gradienten

3.5 Arten von pH-Gradienten

3.6 Präparative Isoelektrische Fokussierung

3.7 Titrationskurvenanalyse

4 Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese

4.1 IEF in IPG-Streifen

4.2 SDS-PAGE

4.3 Proteomik

5 Proteinprobenvorbereitung

5.1 Proteinquantifizierungsmethoden

5.2 Vorbereitung von nativen Proben

5.3 Proben für die SDS-Elektrophorese

5.4 Proben für die hochauflösende 2-D-PAGE

6 Proteindetektion

6.1 Fixierung

6.2 Färbungen nach der Elektrophorese

6.3 Proteinmarkierung

6.4 Differenzgelelektrophorese (DIGE)

6.5 Bildaufzeichnung, Bildanalyse, Spotpicken

7 Blotting

7.1 Transfermethoden

7.2 Blotmembranen

7.3 Puffer für elektrophoretische Transfers

7.4 Allgemeine Anfärbung

7.5 Blockieren

7.6 Spezialdetektion

7.7 Proteinsequenzierung

7.8 Transferprobleme

7.9 Elektroelution von Proteinen aus Gelen

Teil II: Praktische Methodenanleitungen –Ausrüstung und Methoden

Methode 1: PAGE von Farbstoffen

M1.1 Probenvorbereitung

M1.2 Stammlösungen

M1.3 Vorbereitung der Gießkassette

M1.4 Gießen der ultradünnen Gele

M1.5 Elektrophoretische Trennung

Methode 2: Agarose- und Immunelektrophoresen

M2.1 Probenvorbereitung

M2.2 Stammlösungen

M2.3 Herstellung der Gele

M2.4 Elektrophoresen

M2.5 Proteinnachweis

Methode 3: Titrationskurvenanalyse

M3.1 Probenvorbereitung

M3.2 Stammlösungen

M3.3 Herstellung der leeren Gele

M3.4 Titrationskurvenelektrophorese

M3.5 Coomassie- und Silberfärbung

M3.6 Interpretation der Kurven

Methode 4: Native PAGE in amphoteren Puffern

M4.1 Probenvorbereitung

M4.2 Stammlösungen

M4.3 Herstellung der leeren Gele

M4.4 Elektrophorese

M4.5 Coomassie- und Silberfärbung

Methode 5: Agarosegel-IEF

M5.1 Probenvorbereitung

M5.2 Herstellung des Agarosegels

M5.3 Isoelektrische Fokussierung

M5.4 Proteinnachweis

Methode 6: PAGIEF in rehydratisierten Gelen

M6.1 Probenvorbereitung

M6.2 Stammlösungen

M6.3 Herstellung der leeren Gele

M6.4 Isoelektrische Fokussierung

M6.5 Coomassie- und Silberfärbung

M6.6 Methodischer Ausblick

Methode 7: Horizontale SDS-Polyacrylamidelektrophorese

M7.1 Probenvorbereitung

M7.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff

M7.3 Stammlösungen für die Gelherstellung

M7.4 Vorbereitung der Gießkassette

M7.5 Gradienten-Gel

M7.6 Elektrophorese

M7.7 Coomassie- und Silberfärbung

M7.8 Blotting

M7.9 Methodischer Ausblick

Methode 8: Vertikale PAGE

M8.1 Probenvorbereitung und Proteinmarkierung

M8.2 Stammlösungen für die SDS-PAGE

M8.3 Gießen von Einzelgelen

M8.4 Gießen von Mehrfachgelen

M8.5 Elektrophorese

M8.6 SDS-Elektrophorese von niedermolekularen Peptiden

M8.7 Zweidimensional-Elektrophorese

M8.8 DNA-Elektrophorese

M8.9 Langzeitstabile Gele

M8.10 Proteindetektion

M8.11 Präparieren von Glasplatten mit Bind-Silan

Methode 9: Blau-Nativ-PAGE

M9.1 Solubilisierung

M9.2 Stammlösungen

M9.3 Gießen der Gele

M9.4 Elektrophorese

Methode 10: Semidry-Blotting von Proteinen

M10.1 Transferpuffer

M10.2 Technische Durchführung

M10.3 Färbung von Blotfolien

Methode 11: IEF im immobilisierten pH-Gradienten

M11.1 Probenvorbereitung

M11.2 Stammlösungen

M11.3 Immobilinerezepturen

M11.4 Vorbereitung der Gießkassette

M11.5 Herstellung der pH-Gradientengele

M11.6 Isoelektrische Fokussierung

M11.7 Coomassie- und Silberfärbung

M11.8 Strategien der IPG-Fokussierung

Methode 12: Hochauflösende Zweidimensional-Elektrophorese

M12.1 Probenvorbereitung

M12.2 Proteinmarkierung mit einem Fluoreszenzfarbstoff

M12.3 Stammlösungen für die Gelherstellung

M12.4 Gelherstellung

M12.5 SDS-Porengradientengele

M12.6 Trennbedingungen

M12.7 Proteindetektion

Methode 13: Zweidimensional-Differenzgelelektrophorese (DIGE)

M13.1 Planung eines Experiments

M13.2 Probenvorbereitung

M13.3 DIGE-Markierung

M13.4 Vorbereitung für die Probenaufgabe auf die IPG-Streifen

M13.5 Detektion der DIGE-Spots

Methode 14: PAGE von DNA-Fragmenten

M14.1 Stammlösungen

M14.2 Herstellung der Gele

M14.3 Probenvorbereitung

M14.4 Elektrophorese

M14.5 Silberfärbung

Anhang A: Problemlösungen

A.1 Häufige Fehler

A.2 Isoelektrische Fokussierung

A.3 SDS-Elektrophorese

A.4 Zweidimensional-Elektrophorese

A.5 Semidry-Blotting

A.6 PAGE von DNA-Fragmenten

Stichwortverzeichnis

Endbenutzer-Lizenzvereinbarung

Guide

Cover

Table of Contents

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Reiner Westermeier

Elektrophorese leicht gemacht

Ein Praxisbuch für Anwender

2. Auflage

Autor

Reiner Westermeier

Auenstr. 4a

85354 Freising

Deutschland

2. Auflage 2016

Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung.

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Print ISBN 978-3-527-33892-4

ePDF ISBN 978-3-527-69513-3

ePub ISBN 978-3-527-69514-0

Mobi ISBN 978-3-527-69515-7

Geleitwort

Die Anzahl der elektrophoretischen Trennmethoden hat seit Tiselius’ grundlegenden Arbeiten, die mit einem Nobelpreis ausgezeichnet wurden, drastisch zugenommen. Der Weg von der Papier-, Celluloseacetat- und Stärkegelelektrophorese über die Molekularsieb-, Disk-, SDS- und Immunelektrophorese bis hin zur Isoelektrischen Fokussierung einschließlich der hochauflösenden zweidimensionalen Elektrophorese hat zusammen mit der Silber- und Goldfärbung, der Autoradiografie, Fluorografie und den Blottingverfahren zu immer höherer Auflösung, Nachweisempfindlichkeit und Spezifität in der Proteinanalytik geführt. Des Weiteren hat sich die Gelelektrophorese als einzigartiges Werkzeug für die DNA-Sequenzierung erwiesen, während die hochauflösende zweidimensionale Elektrophorese den faszinierenden Weg vom isolierten Protein über die Aminosäurensequenzanalyse zum Gen und nach dessen Klonierung zur Proteinsynthese geebnet hat.

Das Spektrum des Analysenmöglichkeiten ist somit immer vielfältiger geworden, sodass eine zusammenfassende Darstellung der elektrophoretischen Trennmethoden nicht nur für den Anfänger, sondern auch für den erfahrenen Praktiker wünschenswert erscheint. Mit dieser Zielsetzung ist dieses Buch geschrieben worden.

Der Autor gehört zum Kreis der Bluefingers und hat dies 1979 in Mailand hautnah erfahren müssen, als er nach getaner Laborarbeit in einem Zigarettenkiosk aufgrund der Coomassie-gefärbten Hände in den Verdacht des Geldfälschens geriet, und Prof. P.G. Righetti und ich ihn aus einer bedrohlichen Situation befreien mussten. Somit ist bei diesem Buch gemäß Maurers Definition (Proceedings of the first small conference of the bluefingers, Tübingen 1972) ein Experte am Werk gewesen, der den Weißfingern, die die Methoden nur vom Hörensagen kennen, erzählen kann, wie sie z. B. keine blauen Finger bekommen.

Wie dem auch sei, ich bin sicher, dass die zusammenfassende Darstellung der Methoden nicht nur die Weißfinger, sondern auch die Gemeinschaft der Bluefingers, Silverfingers, Goldfingers usw. erfreuen und mit vielen technischen Details bereichern wird.

Weihenstephan, im Februar 1990

Priv.-Doz. Dr. Angelika Görg

Vorwort

25 Jahre nach dem Erscheinen des „Elektrophorese-Praktikums“ und nach vier Auflagen der englischen Version „Electrophoresis in Practice“ gibt es wieder eine deutschsprachige Version mit dem neuen Namen „Elektrophorese leicht gemacht“. Der Titel deutet an, dass auch dieser Band keine tiefgründige theoretische Ableitungen und Erklärungen der Methoden und Phänomene enthält. Der erste Teil soll einen Überblick über die diversen Techniken nach neuestem Stand vermitteln und konzentriert sich auf Hinweise zur praktischen Durchführung von Elektrophoreseexperimenten. Im zweiten Teil findet man praktische Anleitungen zu 14 Methoden und Problemlösungen, die aufgrund der Erfahrungen im täglichen Geschäft eines „Produktspezialisten für Elektrophorese“ bei verschiedenen Technologieanbietern nochmals deutlich erweitert wurden.

Freising, im Juli 2016

R. Westermeier

Vorwort zur ersten Auflage

Dieses Buch ist für die Praktiker im Elektrophoreselabor verfasst worden. Auf physikochemische Ableitungen und Formeln elektrophoretischer Phänomene wurde deshalb verzichtet.

Die Art und Weise der Erklärungen und die Darstellungsform hat sich aus der jahrelangen Erfahrung bei Anwenderseminaren und -kursen, Abfassung von Bedienungsanleitungen und Lösungen von Anwendungsproblemen ergeben. Sie sollten für technische Assistenten ebenso verständlich sein wie für in der Forschung stehende Wissenschaftler.

In Teil I wird so knapp wie möglich – eine Übersicht über den Stand der Technik in der Elektrophorese – gegeben. Die Literaturzitate erheben keinen Anspruch auf Vollständigkeit.

Der Teil II enthält exakte Arbeitsanleitungen für 12 ausgewählte Elektrophoresemethoden, die mit einer apparativen Ausrüstung durchgeführt werden können. Die Reihenfolge der Methoden wurde in der Weise festgelegt, dass man danach einen Elektrophoresekurs für Anfänger und Fortgeschrittene zusammenstellen kann. Mit diesen Methoden ist der Hauptteil der für das biologische, biochemische, medizinische und lebensmittelchemische Labor notwendigen Techniken abgedeckt.

Sollten – trotz exakten Nacharbeitens der Methodenbeschreibungen – unerklärliche Effekte auftreten, kann man deren Gründe und die zu ihrer Vermeidung notwendigen Maßnahmen im Anhang unter der Rubrik „Problemlösungen“ finden.

Für zusätzliche Hinweise und Problemlösungen aus der Leserschaft ist der Autor dankbar.

Freiburg, im März 1990

R. Westermeier

Abkürzungen

A

Ampere

A, C, G, T

Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin

ACES

N-

(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure

AEBSF

Aminoethylbenzylsulfonylfluorid

APS

Ammoniumpersulfat

AU

Absorptionseinheiten (units)

16-BAC

Benzyldimethyl-

n-

hexadecylammoniumchlorid

BAC

Bisacryloylcystamin

Bis

N, N

′

-Methylenbisacrylamid

BNE

Blau-Nativ-Elektrophorese

bp

Basenpaar

BSA

Rinderserumalbumin

C

Vernetzungsgrad (Crosslinking) (%)

CAPS

3-(Cyclohexylamino)propansulfonsäure

CCD

charge-coupled device

CHAPS

3-(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio-1-propansulfat

CM

Carboxymethyl

CoFGE

Komparative (vergleichende) Fluoreszenzgelelektrophorese

const.

konstant

CTAB

Cetyl-trimethylammoniumbromid

Da

Dalton

DBM

Diazobenzyloxymethyl

DEA

Diethanolamin

DEAE

Diethylaminoethyl

DIGE

Differenzgelelektrophorese

Disk

diskontinuierlich

DMF

Dimethylformamid

DMSO

Dimethylsulfoxid

DNA

Desoxyribonukleinsäure

DPT

Diazophenylthioether

dsDNA

Doppelstrang-DNA

DTE

Dithioerythritol

DTT

Dithiothreitol

E

Feldstärke, angegeben in V/cm

EDTA

Ethylendinitrilotetraessigsäure

EEO

Elektroendosmose

EPO

Erythropoietin

ESI

Elektrospray-Ionisation

g/v

Gewicht pro Volumen (Massenkonzentration)

GC

gruppenspezifische Komponente

GLP

Gute Laborpraxis

GMP

Gute Herstellungs (Manufacturing)-Praxis

h

Stunden

HED

Hydroxyethyldisulfid

HEPES

N-

(2-Hydroxyethyl)piperazin-

N

′

-2-ethansulfonsäure

HMW

high molecular weight

HPCE

High Performance Capillary Electrophoresis

HPLC

High Performance Liquid Chromatography

I

Stromstärke, angegeben in A, mA

IEF

Isoelektrische Fokussierung

IgG

Immunglobulin G

IPG

Immobilisierte pH-Gradienten

ITP

Isotachophorese

kb

Kilobasen

kDa

Kilodalton

konz.

konzentriert

K

R

Retardationskoeffizient

LED

light-emitting diode

LIF

Laserinduzierte Fluoreszenz

LMW

low molecular weight

mA

Milliampere

MALDI

Matrix-assistierte Laserdesorptionsionisierung

MCE

Mikrochipelektrophorese

MEKC

Mizellare elektrokinetische Chromatografie

MES

Morpholinoethansulfonsäure

MG

Molekulargewicht

min

Minute

mol/L

Einheit der Molarität

MOPS

Morpholinopropansulfonsäure

m

r

relative elektrophoretische Mobilität

MS

Massenspektrometrie

Ms

n

Massenspektrometrie mit

n

Massenanalyse-Experimenten

MS/MS

Tandem-Massenspektrometrie

MW

Molekulargewicht

NAP

nucleic acid purifier

Nonidet

nicht ionisches Detergens

NEPHGE

Non-Equilibrium pH-Gradient Elektrophoresis

NHS

N-

Hydroxy-Succinimid

O.D.

optische Dichte

P

Leistung (power) angegeben in W

PAG

Polyacrylamidgel

PAGE

Polyacrylamidgelelektrophorese

PAGIEF

Polyacrylamidgel-Isoelektrische-Fokussierung

PBS

phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PC

Personal Computer

PCR

Polymerasekettenreaktion

PEG

Polyethylenglycol

PFG

Pulsed Field Gel(-Elektrophorese)

PGM

Phosphoglucomutase

pI

isoelektrischer Punkt

PI

Proteaseinhibitor

p

K-

Wert

Dissoziationskonstante

PMSF

Phenylmethylsulfonylfluorid

PPA

Piperidinopropionamid

PVC

Polyvinylchlorid

PVDF

Polyvinylidendifluorid

r

Molekülradius

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA

Rf-Wert

relative Laufstrecke

RFLP

Restriktions-Fragmente-Längen-Polymorphismus

R

m

relative elektrophoretische Mobilität

RNA

Ribonukleinsäure

RT

Raumteil (Volumenanteil)

RuBP

Ruthenium-II-tris-bathophenantrolindisulfonat

s

Sekunde

SDS

Natrium (sodium) dodecylsulfat

SNP

single nucleotid polymorphism

SSCP

Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (single strand conformation polymorphism)

ssDNA

single strand (Einzelstrang) DNA

T

Totalacrylamidkonzentration (%)

t

Zeit (time), angegeben in h, min, s

TBE

Tris-Borat-EDTA

TBP

Tributylphosphin

TBS

Tris-gepufferte Salzlösung (Tris-buffered saline)

TCA

Trichloressigsäure (acid)

TCEP

Tris(2-carboxyethyl)phosphine

TEMED

N, N, N

′

,

N

′

-Tetramethylethylendiamin

TF

Transferrin

ToF

Time of Flight (Flugzeit)

Tricin

N-

Tris(hydroxymethyl)-methylglycin

Tris

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U

Spannung, angegeben in V

UpM

Umdrehungen pro Minute

UV

ultraviolettes Licht

V

Volt

V

Volumen, angegeben in L

v

Wanderungsgeschwindigkeit, angegeben in m/s

v/v

Volumen pro Volumen (Volumenanteil)

W

Watt

WiFi

Wireless Local Area Network (Kunstwort)

ZE

Zonenelektrophorese

Teil IGrundlagen

Übersicht

Elektrophoretische Methoden sind neben chromatografischen Methoden die meist verwendeten Trenntechniken für die Analysen von Proteinen, Peptiden, Nukleinsäuren und Glykanen. Mit relativ geringem apparativen Aufwand erreicht man hohe Trennleistungen. Haupteinsatzgebiete sind die Molekularbiologie, biologische und biochemische Forschung, Proteomik, Pharmazeutik, forensische Medizin, klinische Routineanalytik, Veterinärmedizin und Lebensmittelüberwachung. Da die getrennten DNA-Fraktionen mithilfe der Polymerase-Kettenreaktion („PCR“) und Proteine mit hochempfindlichen Massenspektrometriemethoden weiter analysiert werden können, verwischt sich die Einteilung in analytische und präparative Anwendungen. Aber grundsätzlich sind elektrophoretische im Gegensatz zu chromatischen Methoden zur industriellen Proteinaufreinigung nicht geeignet, weil bei der Trennung joulesche Wärme entsteht.

Als eines der ausführlichsten und am meisten praxisbezogenen Bücher über Elektrophoresemethoden sei die Monografie von Andrews (1986) empfohlen. Im vorliegenden Buch Elektrophorese leicht gemacht sollen die Grundlagen der Elektrophoresemethoden und ihre Anwendungen in wesentlich kürzerer Form zusammengestellt werden.

Das Prinzip

In einem elektrischen Gleichstromfeld wandern geladene Moleküle und Partikel jeweils in die Richtung der Elektrode mit entgegengesetztem Vorzeichen. Die Probensubstanzen befinden sich dabei in wässriger Lösung. Verschiedenartige Moleküle und Partikel eines Gemisches wandern aufgrund unterschiedlicher Ladungen und Massen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit und werden dabei in einzelne Fraktionen aufgetrennt.

Die elektrophoretische Mobilität, welche die Wanderungsgeschwindigkeit direkt beeinflusst, ist eine signifikante und charakteristische Größe eines geladenen Moleküls oder Partikels und ist abhängig von den pK-Werten der geladenen Gruppen und der Molekül- bzw. der Partikelgröße. Sie wird beeinflusst von Art, Konzentration und pH-Wert des Puffers, Temperatur, elektrischer Feldstärke sowie der Beschaffenheit des Trägermaterials. Elektrophoretische Trennungen werden entweder in freier Lösung, in trägerfreien Pufferschichten, Kapillaren oder Mikrochips oder in stabilisierenden Medien durchgeführt, wie z. B. auf Dünnschichtplatten, Folien oder Gelen. Ausführliche theoretische Grundlagen findet man im Buch „Bioanalytik“, herausgegeben von Lottspeich und Engels (2012).

Meistens findet man Angaben über die relative elektrophoretische Mobilität (mr oder Rm) von Substanzen. Dabei bezieht man sich auf die Laufstrecke einer mitaufgetrennten Standardsubstanz, um unterschiedliche Feldstärken und Trennzeiten auszugleichen.

Es gibt drei grundsätzlich verschiedene elektrophoretische Trennmethoden:

a) Elektrophorese, korrekterweise Zonenelektrophorese genannt,

b) Isotachophorese,

c) Isoelektrische Fokussierung.

Blotting ist keine Trenn-, sondern eine Nachweismethode.

In Abb. 1 sind die drei Trennprinzipien dargestellt.

Zu a): Bei einfachen Elektrophoresen verwendet man homogene Puffersysteme, die über die gesamte Trenndistanz und -zeit den gleichen pH-Wert gewährleisten. Die in einem definierten Zeitabschnitt zurückgelegten Wanderungsstrecken sind damit ein Maß für die elektrophoretische Mobilität der verschiedenen Substanzen. Dies gilt auch für die Disk-Elektrophorese; das diskontinuierliche System existiert nur zu Beginn und verwandelt sich dann von selbst in ein homogenes.

Zu b): Bei der Isotachophorese (ITP), auf Deutsch Gleichgeschwindigkeitselektrophorese, wird die Trennung in einem diskontinuierlichen Puffersystem durchgeführt. Die ionisierten Probensubstanzen wandern zwischen einem „schnellen“ Leitionelektrolyten (L) und einem „langsamen“ Folgeionelektrolyten (T, von terminierend) mit gleichen Geschwindigkeiten. Dabei sortieren sich die verschiedenen Probenkomponenten nach ihrer elektrophoretischen Mobilität auseinander und bilden einen Stapel: Die Substanzen mit der höchsten Mobilität folgen direkt dem Leition, die mit der niedrigsten Mobilität wandern direkt vor dem Folgeion. Diese Methode wird hauptsächlich für quantitative Analysen eingesetzt.

Abb. 1 Die drei elektrophoretischen Trennprinzipien. Nähere Erläuterungen im Text.

Die ITP wird im Vergleich zu sonstigen elektrophoretischen und chromatografischen Trennungen als exotisch eingeschätzt, weil sich keine Zwischenräume zwischen den Zonen ergeben; die Banden sind keine „Peaks“ (gaußsche Verteilung), sondern „Spikes“ (konzentrationsabhängige Breiten).

Zu c): Die Isoelektrische Fokussierung (IEF) findet in einem pH-Gradienten statt und kann ausschließlich mit amphoteren Substanzen, wie Peptiden und Proteinen, durchgeführt werden. Die Moleküle wandern hierbei – je nach Ladung – in Richtung Anode bzw. Kathode, bis sie im Gradienten an dem pH-Wert ankommen, wo ihre Nettoladung null ist.

Dieser pH-Wert ist der isoelektrische Punkt kurz pI, der jeweiligen Substanz. Da sie dort nicht mehr geladen sind, hat das elektrische Feld keinen Einfluss mehr auf sie. Entfernen sie sich – aufgrund von Diffusion – von dieser Stelle, erhalten sie wieder eine Nettoladung und werden durch das elektrische Feld wieder auf ihren pI zurücktransportiert. Das ergibt einen Konzentrierungseffekt; daher der Name Fokussierung.

Bei der IEF ist es wichtig, die optimale Stelle im pH-Gradienten für den Probenauftrag zu ermitteln und zu verwenden, da manche Proteine bei bestimmten pH-Werten instabil sind oder zum Aggregieren neigen.

Anwendungsbereich

Man verwendet diese Methoden für die qualitative Charakterisierung einer Substanz oder eines Substanzgemisches, für Reinheitsprüfung, Gehaltsbestimmungen und mikropräparative Zwecke.

Der Anwendungsbereich erstreckt sich von ganzen Zellen und Partikel über Nukleinsäuren, Proteine, Peptide, Aminosäuren, organische Säuren und Basen, Drogen, Pestizide bis zu anorganischen Anionen und Kationen – kurz: über alles, was Ladungen tragen kann.

Die Probe

Ein wichtiges Kriterium zur Auswahl der geeigneten Elektrophoresemethode ist die Art der Probesubstanzen, die analysiert werden sollen. In den Probenlösungen dürfen keine festen Partikel oder Fetttröpfchen suspendiert sein, weil diese die Trennung stören, indem sie die Poren der Matrix verstopfen. Meist werden die Probenlösungen vor der Elektrophorese zentrifugiert. Problemlos sind im Allgemeinen Trennungen von Substanzen, die ausschließlich negativ oder positiv geladen sind.

Die Probenaufgabe erfolgt bei Gelen, die sich unter Puffer befinden, wie z. B. Vertikal- und Submarine-Systemen, mit Spritzen in vorgeformte Geltaschen oder in Glasröhrchen durch Unterschichten der mit Glycerin oder Saccharose beschwerten Probe unter den Puffer.

Beispiele solcher Anionen oder Kationen sind: Nukleinsäuren, Farbstoffe, Phenole, organische Säuren oder Basen. Amphotere Moleküle wie Aminosäuren, Peptide, Proteine und Enzyme haben je nach dem pH-Wert des Puffers positive oder negative Nettoladung, weil sie sowohl saure als auch basische Gruppen besitzen.

Makromoleküle, wie Proteine und Enzyme, sind teilweise gegenüber bestimmten pH-Werten oder Puffersubstanzen empfindlich, es können Konfigurationsänderungen, Denaturierungen, Komplexbildungen und zwischenmolekulare Wechselwirkungen auftreten. Dabei spielen auch die Substanzkonzentrationen in der Lösung eine Rolle. Besonders beim Eintritt der Probensubstanzen in eine Gelmatrix können leicht Überladungseffekte auftreten, wenn die Probenkonzentration beim Übergang von der Lösung in das stärker restriktive Gel einen kritischen Wert überschreitet. Bei der Natriumdodecylsulfat (SDS)-Elektrophorese muss die Probe vorher denaturiert, d. h., die Probenmoleküle müssen in die Form von Molekül-Detergens-Mizellen gebracht werden. Die Methode der selektiven Probenextraktion bzw. die Extraktion von schwer löslichen Substanzen bestimmt häufig die Art des verwendeten Elektrophoresepuffers.

Bei offenen Oberflächen wie bei Horizontalsystemen (z. B. in der Celluloseacetat-, Agarosegel- und automatisierten Elektrophorese) verwendet man Probenapplikatoren oder pipettiert mit Mikroliterpipetten in Schlitzmasken, Lochbänder oder vorgeformte Gelwannen. Bei Kapillar- und Mikrochiptechniken verwendet man ebenfalls Spritzen, die meisten Geräte haben jedoch eine automatische Probenaufgabe.

Der Puffer

Die elektrophoretische Trennung von Substanzgemischen erfolgt bei einem genau eingestellten pH-Wert und bei konstanter Ionenstärke des Puffers. Die Ionenstärke des Puffers wird möglichst niedrig gewählt, dann sind der Anteil der Probeionen am Gesamtstrom und damit ihre Wanderungsgeschwindigkeiten genügend hoch.

Die Pufferionen werden während der Elektrophorese ebenfalls – wie die Probeionen – durch das Gel transportiert: negativ geladene zur Anode und positiv geladene zur Kathode. Man will mit möglichst geringer Leistung auskommen, damit während der Elektrophorese nicht zu viel joulesche Wärme entsteht. Es ist aber eine Mindestpufferkapazität erforderlich, damit der pH-Wert der Probesubstanzen keinen Einfluss auf das System nehmen kann.

Für die Aufrechterhaltung konstanter pH- und Pufferbedingungen müssen die Volumina der Elektrodenpuffervorräte genügend groß sein. Sehr praktisch, wenn auch nur in horizontalen Trennsystemen möglich, ist die Verwendung von Gel-Pufferstreifen oder -dochten. Man verwendet bei anionischen Elektrophoresen sehr basische, bei kationischen Elektrophoresen sehr saure Puffersysteme.

Bei Vertikal- und Kapillarsystemen wird der pH-Wert so eingestellt, dass möglichst alle vorhandenen Probesubstanzmoleküle entweder negativ oder positiv geladen sind, sodass sie im elektrischen Feld in die gleiche Richtung wandern.

Abb. 2 Elektroendosmose: Negative Ladungen auf der stationären Phase (Gelmatrix und Oberflächen der Apparaturen) verursachen die Strömung von positiv geladenen Wasserionen in Richtung Kathode. Daraus resultiert ein Wassertransport entgegen der Richtung der elektrophoretischen Wanderung der Probeionen; das führt zu unscharfen Zonen.

Elektroendosmose (EEO)

Das statische Trägermaterial, das stabilisierende Medium (z. B. das Gel) und/oder Oberflächen der Trennapparatur, wie Glasplatten, -röhrchen oder -kapillaren können fixierte Ladungen tragen. Zum Beispiel: Carboxylgruppen, Sulfonylgruppen oder Siliziumoxid werden im basischen oder neutralen Puffer deprotoniert und damit negativ geladen. Die fixen negativen Ladungen werden von der Anode angezogen, können sich aber nicht bewegen. Dies verursacht den Elektroendosmoseeffekt: als Kompensation entsteht eine entgegengesetzte Strömung von H3O+-Ionen in Richtung Kathode. Es kommt zu einer Überlagerung der elektrophoretischen und der elektroosmotischen Bewegung. Der Wassertransport in Richtung Kathode verursacht z. B. das Austrocknen von Gelen an bestimmten Stellen und unscharfe Banden. Elektroendosmoseeffekte sind in den allermeisten Fällen unerwünscht. Es gibt jedoch einzelne Methoden, die diesen Effekt zur Erzielung bestimmter Ergebnisse ausnutzen, z. B. beim Beladen von Kapillaren („elektrokinetisch“), der MEKC oder der Gegenstromimmunelektrophorese (siehe unten).

Die Elektroendosmoseeigenschaft einer Matrix kann man quantifizieren, indem man darin eine Elektrophorese eines Gemisches von Dextran und Albumin durchführt. Durch die Division der Wanderungsdistanz des neutralen Dextrans (OD) durch die Summe beider Wanderungsdistanzen (OD + OA) erhält man den Wert für die EEO (−mr):

Literatur

Andrews, A.T. (1986) Electrophoresis, Theory Techniques and Biochemical and Clinical Applications, Clarendon Press, Oxford.

Lottspeich, F. und Engels, J.W. (Hrsg.) (2012) Bioanalytik, 3. Aufl., Springer Spektrum, Berlin, Heidelberg.

1Elektrophorese

1.1 Allgemeines

1.1.1 Elektrophoresen in freier Lösung

Wandernde-Grenzschichten-Elektrophorese: Für die elektrophoretische Trennung von Substanzen entwickelte Arne Tiselius die Methode der wandernden Grenzschichtenelektrophorese und erhielt dafür, neben seinen Arbeiten auf dem Gebiet der Adsorptionsanalyse, 1948 den Nobelpreis (Tiselius, 1937). In ein mit Puffer gefülltes, U-förmiges Glasrohr, in dessen Enden die Elektroden eingebaut sind, wird die Probe, z. B. ein Proteingemisch, eingebracht. Unter dem Einfluss des elektrischen Feldes wandern die Probenkomponenten je nach Ladungszahl und Ladungsrichtung unterschiedlich schnell in Richtung Anode oder Kathode. Mithilfe einer Schlierenoptik kann man an beiden Enden der Probenzone die dabei entstehenden, durch unterschiedliche Lichtbrechung voneinander abgesetzten Grenzschichten während der Bewegung beobachten (Abb. 1.1).

Die Auflösung ist relativ gering, weil die meisten Zonen, außer den jeweiligen Frontzonen, Mischzonen sind. Die Grenzschichtenelektrophorese in freier Lösung wird heute hauptsächlich in der Grundlagenforschung zur exakten Messung von elektrophoretischen Mobilitäten von Substanzen eingesetzt.

Kontinuierliche trägerfreie Elektrophorese: Bei dieser von Hannig (1982) entwickelten Methode fließt senkrecht zu einem elektrischen Feld ein kontinuierlicher Pufferfilm durch einen 0,5–0,2 mm schmalen Spalt zwischen zwei gekühlten Glas- oder Kunststoffplatten (Free-Flow-System). An der einen Seite wird an einer definierten Stelle die Probe zugeführt, am anderen Ende werden die Einzelfraktionen durch eine Reihe von Schläuchen aufgefangen. Die verschiedenen elektrophoretischen Mobilitäten senkrecht zur Fließrichtung führen zu verschieden starker, aber konstanter Ablenkung der Probenkomponenten, sodass sie an unterschiedlichen Stellen am Ende der Trennkammer auftreffen (siehe Abb. 1.2). Neueste Entwicklungen ermöglichen Feldstärken von über 800 V/cm und Trennungen in weniger als 1 min.

Abb. 1.1 Wandernde-Grenzschichten-Elektrophorese in einem U-Rohr nach Tiselius. Messung der elektrophoretischen Mobilität mit Schlierenoptik.

Abb. 1.2 Schematische Darstellung der kontinuierlichen trägerfreien Elektrophorese (Free-Flow-System).

Neben Trennungen löslicher Substanzen wird diese Technik auch zur Identifizierung, Reinigung und Isolierung von Zellorganellen und -membranen und ganzer Zellen, wie Erythrozyten, Leukozyten, Gewebezellen, Malariaerregern und anderer Parasiten, eingesetzt. Die Methode ist sehr effektiv, da bereits geringe Unterschiede der Oberflächenladungen von Partikeln und Zellen zur Trennung ausgenutzt werden können.

Kapillarelektrophorese: Für analytische und mikropräparative Elektrophoresen ist die Kapillarelektrophorese eine interessante Alternative (Hjertén, 1983): Analog zur HPLC wird sie häufig als HPCE (High Performance Capillary Electrophoresis) bezeichnet. Die Trennung erfolgt in einer 20–30 cm langen, meist offenen Quarzkapillare aus Fused Silica mit 50–100 μm Innendurchmesser; die beiden Enden tauchen in Pufferbehälter ein, in welche die Elektroden eingebaut sind. Die verwendeten Feldstärken liegen in der Größenordnung bis zu 1 kV/cm, die Stromstärke beträgt 10–20 μA; man benötigt deshalb einen Stromversorger, der Spannungen bis zu 30 kV liefern kann. Die joulesche Wärme kann aus diesen dünnen Kapillaren mit einem Gebläse sehr effektiv abgeführt werden. Typische Trennzeiten sind 10–20 min. Die Detektion der Fraktionen erfolgt durch UV-Messung direkt in der Kapillare bei 280, 260 oder in manchen Fällen sogar bei 185 nm. Bei einigen Substanzen erreicht man Nachweisempfindlichkeiten bis in den Attomolbereich. Zur Verhinderung von Adsorption der Probenkomponenten an der Kapillaroberfläche und zur Vermeidung von Elektroosmoseeffekten wird die Kapillareninnenseite meist mit linearem Polyacrylamid oder Methylcellulose belegt. Kapillarelektrophorese-Apparaturen können für alle drei Trennmethoden eingesetzt werden: Elektrophorese, Isotachophorese und Isoelektrische Fokussierung. Die verwendeten Puffer hängen vom Trennproblem ab: z. B. 20–30 mmol/L Natriumphosphatpuffer pH 2,6 für die Elektrophorese von Peptiden.

Mizellare elektrokinetische Chromatografie (MEKC) eingeführt von Terabe et al. (1984) ist eine elektrophoretische Methode, mit welcher man sowohl neutral als auch geladene Substanzen auftrennen kann. Hierbei werden Tenside über der kritischen Mizellenkonzentration eingesetzt. Die geladenen Mizellen wandern in die Gegenrichtung des vom Quarzglas verursachten elektroosmotischen Flusses. Die elektroosmotische Strömung ist schneller als die Wanderung der Mizellen, welche mit den Probensubstanzen hydrophobisch und elektrostatisch interagieren wie bei einer Chromatografie.

Ein Vorteil der Kapillarelektrophorese liegt in der Automatisierung. So gehört bei solchen Geräten eine automatische Probenaufgabe zum Standard (Abb. 1.3). Ein weiterer Vorteil ist die Möglichkeit der Kopplung mit anderen analytischen Instrumenten sowohl vor der Elektrophorese: HPLC/HPCE; als auch danach: HPCE/Massenspektrometer. Für präparative Trennungen verwendet man hinter dem UV-Detektor einen Fraktionensammler. Im Gegensatz zur Reversed-Phase-Chromatographie werden Proteine bei der HPCE nicht geschädigt, außerdem erhält man eine höhere Auflösung. Einzelne Fraktionen können deshalb auch innerhalb der Kapillare mit Antikörpern detektiert und identifiziert werden (siehe Kapitel 7, Blotting-Methoden).

Praktische Informationen zur Kapillarelektrophorese findet man in dem von Robert Weinberger (2000) herausgegebenen Buch.

Wegen der Automatisierungsmöglichkeit, der Parallelisierung für Hochdurchsatzanalysen und der Wiederverwendbarkeit der Kapillaren wurde die Kapillarelektrophorese die zentrale Methode zur DNA-Sequenzierung und damit zur Entzifferung von Genomen. Seitdem Next-Generation-Genome-Sequencing-Methoden eingeführt worden sind, welche nicht mehr auf Elektrophorese basieren, werden die Multikapillarsysteme für andere Applikationen eingesetzt, vor allem für automatisierte Hochdurchsatzanalysen komplexer Zuckerstrukturen (Schwarzer et al., 2008).

Abb. 1.3 Schematische Darstellung eines Kapillarelektrophoresesystems.

Allerdings ist die Investition für ein trägerfreies Elektrophoresesystem oder ein Kapillarelektrophoresegerät deutlich höher als für eine Gelelektrophoreseausrüstung.

Mikrochipelektrophorese (MCE) ist im Prinzip eine miniaturisierte Kapillarelektrophorese in einer planaren Anordnung. Sie ermöglicht einen höheren Grad der Automatisierung und noch schneller Analysen. Probenaufgabe und -trennung erfolgt in schmalen Kanälen, welche durch fotolithografische Prozeduren in die Oberfläche von Glas-, Silikon- oder Polymerplättchen eingeätzt wurden. Meist sind die Kanäle in der Form eines Kreuzes angeordnet in der Größenordnung von 1–10 cm mit ca. 50 μm Durchmesser (siehe Abb. 1.4). Alle Reservoirs enthalten Elektroden für Probeninjektion und die Trennung. Das Probenvolumen für die MCE im Vergleich zur CE beträgt ein Zehntel: ca. 0,1–0,5 nL, und wird meistens elektrokinetisch appliziert. Bei Spannungen von 1–4 kV sind die Trennungen etwa viermal schneller als in der CE: 50–200 s. Die Visualisierung der Zonen erfolgt entweder durch laserinduzierte Fluoreszenz (LIF), wie in der Publikation von Schulze et al. (2010) beschrieben, oder mit elektrochemischer Detektion. Letztere Methode eignet sich am besten zur Detektion von niedermolekularen Analyten.

Abb. 1.4 Schematische Darstellung der Mikrochipelektrophorese.

1.1.2 Elektrophoresen in stabilisierenden Medien

Stabilisierende Medien können aus Papier oder Folien bestehen, meist werden aber Gele verwendet. Um den Verlauf der Trennung beobachten zu können und den Endpunkt der Trennung zu erkennen, lässt man Farbstoffe mit hohen elektrophoretischen Mobilitäten mit der Probe mitlaufen: Bei Proteintrennung in Richtung Anode verwendet man meist Bromphenolblau oder Orange G, in Richtung Kathode Bromkresolgrün oder Methylenblau, für Nukleinsäuretrennungen Xylencyanol.

Die Arbeitsanleitungen im zweiten Teil beschränken sich auf Elektrophoresen im stabilisierenden Medium, weil diese Techniken mit dem geringsten Geräteaufwand durchgeführt werden können.

Der Nachweis der getrennten Zonen erfolgt entweder unmittelbar im Trennmedium durch Anfärben, Ansprühen mit spezifischen Reagenzien, durch Enzym-Substrat-Kopplungsreaktionen, Immunpräzipitation, Autoradiografie, Fluorografie oder mittelbar durch Immunprinting oder mit Blotting-Methoden.

Papier- und Dünnschichtelektrophorese: Diese Techniken sind zum großen Teil aufgrund der besseren Trenneigenschaften und der höheren Beladungskapazität von Agarose- und Polyacrylamidgelen durch Methoden der Gelelektrophorese abgelöst worden. Lediglich zur Analyse von hochmolekularen Polysacchariden und Lipopolysacchariden, welche die Gelporen verstopfen können, werden elektrophoretische Trennungen auf horizontalen Kieselgeldünnschichtplatten durchgeführt, die seitlich mit Puffertanks verbunden sind (Scherz, 1990).

Celluloseacetatfolien sind großporig, sodass sie keine Siebwirkung auf Proteine ausüben. Elektrophoretische Trennungen in diesem Material sind deshalb rein ladungsabhängig. Die Matrix wirkt kaum der Diffusion entgegen, die getrennten Zonen sind relativ breit, die Auflösung und die Nachweisempfindlichkeit sind relativ niedrig. Auf der anderen Seite ist ihre Handhabung sehr einfach, Trennung und Anfärben funktionieren schnell (Kohn, 1957). Dafür werden einfach konstruierte Horizontalkammern verwendet: Die Celluloseacetatstreifen werden in die Kammern eingehängt, sodass die beiden Enden in die Pufferlösung eintauchen; eine Kühlung während der Trennung ist überflüssig. Diese Technik ist weitverbreitet in der klinischen Routine und verwandten Anwendungsgebieten für die Untersuchung von Serum und zur Analyse von Isoenzymen in physiologischen Flüssigkeiten. Informationen zur Elektrophorese in der klinischen Diagnostik sind im Lexikon der Medizinischen Laboratoriumsdiagnostik zu finden (Gressner und Arndt, 2013).

1.1.3 Gelelektrophorese

1.1.3.1 Geltypen

Die Gelmatrix soll möglichst kontrolliert einstellbare und gleichmäßige Porengrößen haben, chemisch inert sein und keine Elektroosmose besitzen.

Stärkegele, von Smithies (1955) eingeführt, werden aus hydrolysierter Kartoffelstärke hergestellt, die man durch Aufkochen löst und in 5–10 mm dicker Schicht ausgießt. Die Porengröße wird durch den Stärkegehalt der Lösung eingestellt. Stärke ist ein Naturprodukt, dessen Eigenschaften stark variieren können. Wegen der mangelnden Reproduzierbarkeit und der unpraktischen Handhabung diese Gele werden sie immer mehr von Polyacrylamidgelen abgelöst.

Dextrangele sind fast ausschließlich für präparative Anwendungen ohne Siebeffekte verwendet worden, wie für die Isoelektrische Fokussierung (Radola, 1975).

Abb. 1.5 Chemische Formel der Agarose und Ausbildung der Gelstruktur beim Gelieren.

Agarosegele werden insbesondere dann verwendet, wenn man große Poren für Analysen von Molekülen über 10 nm Durchmesser benötigt. Agarose ist ein Polysaccharid und wird aus roten Meeresalgen hergestellt. Durch Entfernen des Agaropektins erhält man unterschiedliche Elektroosmose- und Reinheitsstufen. Die Charakterisierung erfolgt durch die Schmelztemperatur (35–95 °C) und den Grad der Elektroosmose (mr