Taschenlehrbuch Biologie: Genetik E-Book

• Herausgeber: Thieme
• Kategorie: Wissenschaft und neue Technologien
• Serie: Taschenlehrbuch Biologie
• Sprache: Deutsch

Seitenzahl: 787

Veröffentlichungsjahr: 2017

Beschreibung

Im Bachelor-Studium der Biologie erlernst du in kurzer Zeit das Grundwissen aller biologischen Fachdisziplinen. Die Taschenlehrbuch-Reihe zur Biologie unterstützt dich dabei und vermittelt dir ein fundiertes Verständnis für biologische Zusammenhänge und Prinzipien. Dieser Band zur Genetik vermittelt dir einen Einblick in die moderne Genetik. Die Mechanismen der Genexpression, Rekombination, Mutation und Genregulation werden für Bacteria, Archaea und Eukarya vergleichend dargestellt. Die Vorgänge bei der Meiose und der Geschlechtsbestimmung sowie die verschiedenen Modellorganismen werden vorgestellt, ebenso die gentechnischen Methoden. Das didaktische Konzept macht das Lesen zum Vergnügen: - Zusammenfassungen zum Kapitelbeginn führen in den Text ein und geben einen ersten Überblick. - Kurz gefasste, aber dennoch verständliche Texte mit vielen Hervorhebungen sind leicht zu erfassen. - Farbig markierte Abschnitte informieren dich über Anwendungsmöglichkeiten und über konkrete Methoden. - Zahlreiche farbige Abbildungen helfen dir, dir komplexe Sachverhalte leicht zu erschließen. - Repetitorien am Ende der Abschnitte greifen die wichtigsten neuen Begriffe nochmals auf und sind ideal zum Lernen und zum Nachschlagen! Die Taschenlehrbuch-Reihe zur Biologie – unverzichtbar für dein Studium! Jederzeit zugreifen: Der Inhalt des Buches steht dir ohne weitere Kosten digital in der Wissensplattform eRef zur Verfügung (Zugangscode im Buch). Mit der kostenlosen eRef App hast du zahlreiche Inhalte auch offline immer griffbereit.

Leseprobe

Taschenlehrbuch Biologie

Taschenlehrbuch Biologie: Genetik

Katharina Munk

Dieter Jahn, Klaus Wolf, Martina Jahn, Inge Kronberg, Thomas Langer, Regina Nethe-Jaenchen, Harald Schlatter, Beate Schultze, Johannes Siemens, Jörg Soppa

2. unveränderte Auflage

344 Abbildungen

Vorwort

Für die Studierenden wird es immer schwieriger bei dem wachsenden Informationsangebot und der Flut an täglich neu hinzukommenden Forschungsergebnissen im Rahmen des kurzen Bachelor-Studiums der Biologie, ein Verständnis für biologische Zusammenhänge und Prinzipien zu entwickeln. Die verschiedenen biologischen Fachbücher als Reihe herauszubringen, bietet die Möglichkeit, die Zusammenhänge zwischen den Fachgebieten herauszuarbeiten. Vier Bände enthalten das relevante Grundwissen der Zoologie, Botanik, Mikrobiologie und Genetik. Um die Gemeinsamkeiten der Organismen herauszustellen und gleichzeitig die Überschneidungen zwischen den Bänden möglichst gering zu halten, haben wir diesen „klassischen“ Fächern zwei übergreifende Bände zur Seite gestellt: Den Band Biochemie · Zellbiologie, der sich mit der Zelle als der kleinsten Lebenseinheit beschäftigt, und der Band Evolution · Ökologie, der sich mit Interaktionen befasst, die über den einzelnen Organismus hinausgehen und ganze Lebensgemeinschaften und Ökosysteme betreffen.

Die meisten der an der Buchreihe beteiligten über 40 Autoren sind in Lehre und Forschung erfahrene Dozenten ihrer Fachgebiete. Ihre Erfahrungen mit den seit einigen Jahren laufenden Bachelor-Studiengängen haben sie in diese Taschenbücher eingebracht, die Stofffülle auf ein überschaubares Basiswissen reduziert und durch eine fächerübergreifende, vergleichende Darstellung und viele Verweise Querverbindungen zwischen den einzelnen biologischen Disziplinen hergestellt. So vermitteln die Bände einen zusammenhängenden Überblick über die Basisinhalte der Biologie.

In dem Band Genetik wird in den Kapiteln zu Nucleinsäuren, Genomstruktur, DNA-Replikation, Transkription und Translation den Unterschieden bzw. Gemeinsamkeiten zwischen Bacteria, Archaea und Eukarya besondere Beachtung geschenkt. Die Vorgänge bei der Meiose und der Geschlechtsbestimmung sowie die Formalgenetik gehören ebenso zu den Grundlagen der Genetik wie die wichtigsten gentechnischen Methoden, die aus der medizinischen und biologischen Forschung nicht mehr wegzudenken sind. Verbesserte gentechnische Methoden erzeugen zunehmende Datenmengen, die, in zahlreichen Datenbanken abgelegt, zur Verfügung stehen. In der Systembiologie werden die Daten der DNA-Sequenzierung, Transkriptomic und Metabolomic zu neuen Modellen zusammengeführt. Angesichts der Flut an neu entdeckten Mechanismen und Faktoren auf dem Gebiet der Rekombination und Regulation ist es den Autoren gelungen, die zahlreichen Einzelergebnisse verständlich auf allgemeingültige und übergeordnete Mechanismen zu reduzieren.

Die Ursprünge dieser Taschenlehrbuch-Reihe zur Biologie gehen auf eine Initiative des Gustav Fischer Verlages im Sommer 1997 zurück. An dieser Stelle möchte ich ganz besonders Herrn Dr. Arne Schäffler danken, der damals das Zustandekommen der Reihe ermöglichte und mit seinen vielen wertvollen Ratschlägen ihren Werdegang begleitet hat. Ermutigt durch den Erfolg der ersten Auflage, die 2000 und 2001 unter dem Namen Grundstudium Biologie im Spektrum-Verlag erschien, und die starke positive Resonanz von Studenten und Dozenten, haben wir eine neue Auflage in Angriff genommen, die mittlerweile durch zahlreiche neue Autoren unterstützt wird.

Mein besonderer Dank gilt dem Georg Thieme Verlag für die neue Herausgabe der Reihe in ihrer jetzigen Taschenbuchform und der großzügigen farbigen Gestaltung. Frau Marianne Mauch als verantwortliche Programmplanerin danke ich für ihre Begeisterung für das Projekt, die effiziente Hilfe und ihre wertvolle Unterstützung bei der Weiterführung des Konzepts. Die Zusammenarbeit macht mir sehr viel Spaß. Frau Elsbeth Elwing hat mit ihrer fröhlichen Ruhe stets alle noch so aussichtslosen Terminprobleme bei der Herstellung gelöst. Auch allen anderen Mitarbeitern des Verlages, die mit ihrer Arbeit zum Gelingen der Bände beigetragen haben, sei gedankt. Besonders auch Michael Zepf, der alle meine technischen Anfragen immer rasch und zuverlässig beantwortet hat und Willi Kuhn für die Sachverzeichnis-Bearbeitung.

Besonders bedanke ich mich auch bei Frau Christiane von Solodkoff sowie bei Frau Henny Bernstädt-Neubert für die sehr persönliche Zusammenarbeit und die kreative und professionelle Umsetzung – zeitweilig im Dauereinsatz – der teilweise chaotischen Vorlagen in die nun hier vorliegenden, hervorragend gelungenen Abbildungen.

Dieter Kapp (Bielefeld), My-Linh Du (Berlin), Tilbert Kosmehl (Berlin), Peter Jeppesen (Edinburgh), Frantisek Marec (Ceske Budejovice, Tschechien), Heinz Winking (Lübeck), Helmut Zacharias (Langwedel), Manfred Rohde (Braunschweig), Adrian Sumner (Edinburgh, UK), Philippe Fournier (Saint-Christol-lez-Alès, Frankreich), Gerald G. Schumann (Langen), Alicja and Andrzej Stasiak (Lausanne) und Eberhard Schleiermacher (Mainz) danke ich ganz herzlich für die zur Verfügung gestellten Originale und Abbildungen.

Für die geniale Unterstützung im Hintergrund danke ich meiner Mutter, die für unser leibliches Wohlergehen sorgte, meiner Tochter, die mich daran erinnerte, dass auch die Familie interessant sein kann, meinen beiden Söhnen für die kompetente und permanente Computerbetreuung ohne jegliche Pannen und Abstürze und meinem Ehemann Matthias Munk für die vielen fachlichen Diskussionen und Ermutigungen.

Das hier vorliegende Werk ist eine Gemeinschaftsleistung aller an der Buchreihe beteiligten Autoren. Mit großem Einsatz haben sie nicht nur die eigenen Kapitel geschrieben, die anderen Kapitel korrigiert, sondern auch mit vielen konstruktiven Anregungen zu den Inhalten der anderen Bände fachübergreifende Zusammenhänge hergestellt. Wir hoffen, dass dadurch ein Gesamtwerk entstanden ist, dessen Lektüre Ihnen nicht nur gute Voraussetzungen für das Bestehen Ihrer Prüfungen vermittelt, sondern auch Ihre Begeisterung für das Fach Biologie weckt.

Wir wünschen Ihnen viel Erfolg in Ihrem Studium!

Dr. Katharina Munk E-Mail: [email protected] Oktober 2009

Inhaltsverzeichnis

Vorwort

1 Nucleinsäuren, Chromatin und Chromosomen

1.1 Die DNA trägt die erblichen Eigenschaften eines Organismus

1.2 DNA- und RNA-Bausteine

1.3 Bau der Nucleinsäuren

1.3.1 Nucleotidketten und Basenpaarung

1.3.2 Die DNA-Doppelhelix

1.3.3 Die Quadruplex-DNA

1.4 Eigenschaften der Nucleinsäuren

1.4.1 Absorption von ultraviolettem Licht

1.4.2 Schmelzen und Renaturierung der DNA

1.4.3 Haarnadelschleife

1.5 Organisation der prokaryotischen Chromosomen

1.5.1 Organisation der Genome von Bakterien

1.5.2 Organisation der Genome von Archaea

1.6 Bau eukaryotischer Chromosomen

1.6.1 10-nm-Faden (Primärstruktur)

1.6.2 30-nm-Faden (Sekundärstruktur)

1.6.3 Schleifendomänen (Tertiärstruktur)

1.6.4 Chromatiden (Quartärstruktur)

1.6.5 Funktionselemente von Chromosomen

1.7 Chromosomenanalyse

1.7.1 Analyse von sehr kleinen Chromosomen

1.7.2 Cytogenetik

1.8 Ungewöhnliche Chromosomenformen

1.8.1 Lampenbürstenchromosomen

1.8.2 B-Chromosomen

1.8.3 Mikrochromosomen

2 Genomstruktur

2.1 Organisation und Größe von Genomen

2.2 Virale Genome

2.2.1 Bakteriophagen

2.2.2 Eukaryoten-Viren

2.3 Prokaryotische Genome

2.3.1 Das Chromosom der Bacteria

2.3.2 Das Chromosom der Archaea

2.3.3 Transposons bei Prokaryoten

2.3.4 Plasmide

2.4 Eukaryotische Genome

2.4.1 Das Kerngenom

2.4.2 Das Plasmon

2.5 Genomik

2.5.1 Das Humangenomprojekt

3 DNA-Replikation

3.1 Grundschema der Replikation

3.1.1 Semikonservative Verdopplung

3.1.2 Semidiskontinuierliche Verdopplung

3.1.3 Simultane Verdopplung

3.2 Ablauf der Replikation

3.2.1 Replikationsinitiation

3.2.2 Replikationselongation

3.2.3 Replikationstermination

3.3 Replikation bei Bacteria

3.3.1 Ablauf der Replikation bei Bacteria

3.3.2 Kontrolle der Replikation in Bacteria

3.4 Replikation bei Archaea

3.5 Replikation bei Viren

3.5.1 Virale Replikationsmechanismen

3.6 Replikation bei Eukarya

3.6.1 Ablauf der mitotischen Replikation

3.6.2 Kontrolle von Replikation und Zellteilung in Eukarya

3.6.3 DNA-Endoreplikation

4 Transkription

4.1 Allgemeine Prinzipien der Transkription

4.2 Transkription bei Bacteria

4.2.1 Initiation

4.2.2 Termination

4.2.3 Prozessierung der RNA

4.3 Transkription bei Eukaryoten

4.3.1 Orte der Transkription

4.3.2 Promotoren und Enhancer eukaryotischer Gene

4.3.3 Faktoren: TF, TBP, TAF, Transkriptionsaktivatoren und Coaktivatoren

4.3.4 Initiation

4.3.5 Elongation

4.3.6 Cotranskriptionales Prozessieren: Capping, Spleißen und Polyadenylierung

4.3.7 Termination

4.3.8 Nachträgliches Ändern der RNA-Sequenz: Editing

4.4 Transkription bei Archaea

4.4.1 Initiation, Elongation und Termination

4.4.2 Spleißen bei Archaea

5 Translation

5.1 Allgemeine Prinzipien der Translation

5.1.1 Der genetische Code

5.1.2 Der genetische Code ist (fast) universell

5.2 Mittler zwischen mRNA und Protein: die tRNA

5.2.1 Die Struktur der tRNA

5.2.2 Prozessierung und Modifikation von tRNAs

5.2.3 Beladung der tRNAs: Aminoacyl-tRNA-Synthetasen

5.2.4 Variabel aber nicht beliebig: „Wobbeln“

5.3 Orte der Translation: Ribosomen

5.3.1 Struktur der Ribosomen

5.3.2 Bildung von Ribosomen in Bacteria

5.3.3 Bildung von Ribosomen in Eukarya

5.3.4 Bildung von Ribosomen in Archaea

5.4 Verlauf der Translation: Initiation, Elongation, Termination

5.4.1 Initiation bei Bacteria

5.4.2 Elongation bei Bacteria

5.4.3 Termination bei Bacteria

5.4.4 Initiation bei Eukaryoten

5.4.5 Elongation und Termination bei Eukaryoten

5.4.6 Translation bei Archaea

5.4.7 Translationsgenauigkeit: Pedantisch oder „quick and dirty“ ?

5.4.8 Das Ribosom als Angriffspunkt für Antibiotika

5.5 Aus dem Leben eines Proteins: Faltung, Translokation, Degradation

5.5.1 Faltung naszierender Proteine

5.5.2 Translokation durch die Membran

5.5.3 Posttranslationale Modifikation

5.5.4 Das Ende: Degradation

6 Meiose

6.1 Die Bedeutung der Meiose

6.2 Die Phasen der Meiose

6.2.1 Leptotän der Prophase I

6.2.2 Zygotän der Prophase I

6.2.3 Pachytän der Prophase I

6.2.4 Diplotän und Diakinese der Prophase I

6.2.5 Prometaphase I und Metaphase I

6.2.6 Anaphase I

6.2.7 Telophase I und Interkinese

6.2.8 Prophase II bis Telophase II

6.3 Rearrangierte Chromosomen in der Meiose

6.3.1 Auswirkungen von Robertson-Translokationen

6.3.2 Auswirkungen von reziproken Translokationen

6.3.3 Auswirkungen von Inversionen

6.3.4 Achiasmatische Meiose

7 Formalgenetik

7.1 In der Formalgenetik wichtige Grundbegriffe

7.1.1 Genotyp und Phänotyp

7.1.2 Dominanz und Kodominanz

7.1.3 Vereinbarungen der Schreibweise

7.2 Probleme bei der genetischen Analyse

7.2.1 Pleiotropie und Polygenie

7.2.2 Penetranz und Expressivität

7.2.3 Umwelteinflüsse und Reaktionsnorm

7.3 Modellorganismen

7.3.1 Pisum sativum (Erbse)

7.3.2 Zea mays (Mais)

7.3.3 Drosophila melanogaster (Taufliege)

7.4 Die Mendel-Regeln

7.4.1 Die Methode Mendels

7.4.2 Erste Mendel-Regel (Uniformitätsregel)

7.4.3 Zweite Mendel-Regel (Spaltungsregel)

7.4.4 Dritte Mendel-Regel (Unabhängigkeitsregel)

7.5 Gekoppelte Gene und Genkartierung

7.6 Geschlechtsgebundene Vererbung

7.7 Stammbaumanalyse

7.7.1 Autosomal dominanter Erbgang

7.7.2 Autosomal rezessiver Erbgang

7.7.3 X-Chromosom-gebundene Vererbung

7.8 Formalgenetik bei haploiden Organismen

7.9 Ausnahmen von den Mendel-Regeln

7.9.1 Formalgenetik der Mitochondrien

7.9.2 Formalgenetik der Plastiden

7.9.3 Maternale cytoplasmatische Effekte

7.9.4 Genomic Imprinting

8 Geschlechtsbestimmung

8.1 Grundlagen der Geschlechtsbestimmung

8.2 Grundlagen der genotypischen Geschlechtsbestimmung

8.3 Dosiskompensation

8.4 Sexuelle Differenzierung in Drosophila melanogaster

8.5 Sexuelle Differenzierung in Caenorhabditis elegans

8.6 Sexuelle Differenzierung in Säugetieren

8.6.1 Das primäre Signal

8.6.2 Die sekundäre Entwicklung (Geschlechtsdifferenzierung)

8.7 Haplodiploidie

8.8 Geschlechtsbestimmung bei Pflanzen

8.9 Geschlechtsbestimmung durch Umweltfaktoren

8.10 Endokrine Ökotoxine

9 Rekombination

9.1 Einleitung und Übersicht

9.2 Homologe Rekombination

9.2.1 Formaler Ablauf

9.2.2 Biochemie der homologen Rekombination

9.2.3 Homologe Rekombination in biologischen Prozessen

9.3 Ortsspezifische Rekombination

9.3.1 Formaler Ablauf

9.3.2 Biochemie von zwei konservierten Proteinfamilien

9.3.3 Ortsspezifische Rekombination in biologischen Prozessen

9.4 Transposition und Retrotransposition

9.4.1 DNA-Transposons

9.4.2 Poly(A)-Retrotransposons

9.4.3 LTR-Retrotransposons

9.5 Ein „gezähmtes Transposon“ und das Immunsystem höherer Eukaryoten

9.6 Rekombination und menschliche Krankheiten

9.7 Evolution durch Rekombination und Evolution der Rekombination

9.7.1 Evolution durch Rekombination

9.7.2 Evolution der Rekombination

9.8 Anwendung der Rekombination in Forschung, Biotechnologie und Gentherapie

10 Mutation und Reparatur

10.1 Welche Mutationen gibt es?

10.1.1 Punktmutationen

10.1.2 Chromosomenmutationen

10.1.3 Genommutationen

10.2 Häufigkeit und Richtung spontaner Mutationen

10.2.1 Spontane Mutationen sind ungerichtet

10.2.2 Häufigkeit spontaner Mutationen

10.3 Ursachen für Mutationen

10.3.1 Zerfallsreaktionen von Nucleinsäuren

10.3.2 Einbau falscher Basen führt zu Fehlpaarungen

10.3.3 Reaktionen mit Nucleinsäuren – chemische Mutagenese

10.3.4 Basananaloga und interkalierende Substanzen

10.3.5 Strahleninduzierte Mutationen

10.3.6 Repetitive Trinucleotid-Sequenzen: Dynamische Mutationen

10.3.7 Mutationen durch „entsprungene Gene“

10.3.8 Zielgerichtete Mutagenese

10.4 Reparatur von DNA-Schäden

10.4.1 Direkte Reparatur modifizierter Basen

10.4.2 Die Basen-Excisions-Reparatur

10.4.3 Die Nucleotid-Excisions-Reparatur

10.4.4 Die Mismatch-Reparatur

10.4.5 Reparatur durch Rekombination

10.4.6 Reparatur von Einzel- und Doppelstrangbrüchen

10.4.7 SOS-Reparatur

10.5 Suppression von Mutationen

11 Kontrolle der Genexpression und Systembiologie

11.1 Ebenen der Genexpressionskontrolle

11.2 Genomstruktur und Genexpression

11.2.1 Regulation der Genexpression über die Genomstruktur in Bakterien

11.2.2  Regulation der Genexpression über die Genomstruktur in Eukaryoten

11.3 Transkriptionskontrolle in Prokaryoten

11.3.1 Alternative Sigmafaktoren

11.3.2 Zweikomponenten-Regulationssysteme

11.3.3 Repressoren und Aktivatoren – negative und positive Kontrolle

11.3.4 Regulation des lac-Operons durch den Lac-Repressor und den Crp-Aktivator

11.3.5 Komplexe Regulation der Stationärphase und generellen Stressantwort

11.4 Transkriptionskontrolle in Eukaryoten

11.4.1 Chromatinstruktur und Genregulation

11.4.2 Promotorelemente und Transkriptionsfaktoren

11.4.3 Häufige Regulatoren proximaler Promotorelemente

11.4.4 Spezialisierte Transkriptionsregulatoren und ihre Promotorelemente

11.4.5 Enhancer und Silencer

11.4.6 Kopplung von Transkription und RNA-Prozessierung

11.4.7 Methylierung und Epigenetik

11.5 Signaltransduktion in Eukaryoten

11.5.1 Prinzipien der Signaltransduktion

11.5.2 Sieben-Transmembranhelix-(7TM-)Rezeptoren und G-Protein-vermittelte Signalwege

11.5.3 Intrazelluläre Signalsubstanzen – Second Messenger

11.5.4 Signaltransduktion durch pflanzliche Hormone

11.5.5 Signalwege über Serin/Threonin-spezifische Proteinkinasen

11.5.6 Cytokinrezeptoren und der JAK-STAT-Signalweg

11.5.7 Wachstumsfaktoren und Rezeptor-Tyrosinkinase

11.5.8 Von der Membran über Ras und MAP-Kinaseweg in den Zellkern

11.5.9 Toll-like-Rezeptoren

11.6 Posttranskriptionelle Kontrolle der Genexpression

11.6.1 Alternatives Spleißen

11.6.2 MicroRNAs und RNAi in Eukaryoten

11.6.3 RNA-abhängige Regulation in Bakterien

11.6.4 Regulierte RNA-Stabilität

11.6.5 Gesteuerte mRNA-Lokalisation und Translation

11.7 Translationskontrolle in Eukaryoten

11.8 Systembiologie

11.8.1 Systembiologie

11.8.2 Genome und Genomics

11.8.3 Transkriptom und Transkriptomics

11.8.4 Proteom, Proteomics und Interactomics

11.8.5 Metabolom und Fluxom

11.8.6 Bioinformatische Modellbildung

12 Methoden der Molekularbiologie

12.1 Einleitung

12.1.1 Entwicklung der Molekularbiologie

12.1.2 Molekularbiologisches Arbeiten heute

12.1.3 Sicherheit und gesetzliche Grundlagen

12.2 In-vitro–Methoden der Molekularbiologie

12.2.1 Reinigung von Nucleinsäuren

12.2.2 Gelelektrophorese

12.2.3 Einsatz von Restriktionsendonucleasen

12.2.4 Ligation

12.2.5 Polymerasekettenreaktion

12.2.6 Sequenzierungsmethoden und Genomsequenzierung

12.2.7 Reverse Transkription

12.2.8 Hybridisierung

12.2.9 Mikroarray-Analysen

12.2.10 Genom-, cDNA- und Umwelt-DNA-Bibliotheken

12.2.11 In-vitro-Transkription und In-vitro-Translation

12.2.12 In-vitro-Evolution

12.2.13 Chemische DNA-Synthese

12.2.14 Molekulare Marker (für die Züchtung und in der Medizin)

12.2.15 Genetisches Screening und Genetischer Fingerabdruck

12.2.16 Analyse von Populationsstrukturen

12.3 In-vivo-Methoden der Molekularbiologie

12.3.1 Transformation

12.3.2 Regeneration vielzelliger Organismen

12.3.3 Heterologe Produktion von Proteinen

12.3.4 Expressionsanalysen mittels GFP

12.3.5 Analyse von Protein-Protein-Wechselwirkung

12.3.6 Deletion von Genen und konditionale Depletion von Proteinen

12.4 In-silico-Methoden der Molekularbiologie

Anschriften

Impressum

1 Nucleinsäuren, Chromatin und Chromosomen

Klaus W. Wolf, Jörg Soppa (1.5)

1.1 Die DNA trägt die erblichen Eigenschaften eines Organismus

Desoxyribonucleinsäure (desoxyribonucleic acid, DNA) und Ribonucleinsäure (ribonucleic acid, RNA) sind in allen Organismen vorhanden. Die DNA stellt als doppelsträngige Helix (DNA-Doppelhelix) das Erbgut der Bacteria, Archaea und Eukarya dar, während die RNA vorwiegend eine Rolle beim Informationsfluss in der Zelle spielt. Eine Ausnahme sind die Viren. Sie besitzen immer nur eine Art von Nucleinsäuren, entweder DNA oder RNA, die sowohl als einzelsträngige als auch als doppelsträngige Genome vorkommen. Die genetische Information wird über die Vorgänge der Transkription und Translation der Zelle zugänglich gemacht.

Der Tübinger Forscher Friedrich Miescher gilt als der Entdecker der Nucleinsäuren. Er isolierte in den Sechziger- und Siebzigerjahren des 19. Jahrhunderts aus tierischen und menschlichen Geweben eine Substanz, die er Nuclein nannte, da er diese Substanz aus dem Nucleus, also dem Zellkern, isoliert hatte. Man geht heute davon aus, dass er in seinen Experimenten keine reinen Nucleinsäuren vor sich hatte, sondern eine Mischung aus Proteinen und Nucleinsäuren. Die erste Isolierung von proteinfreien Nucleinsäuren gelang Richard Altman im Jahr 1889. Er prägte auch den Begriff Nucleinsäuren. Der Begriff der Chromosomen, das sind die Einheiten, in denen das genetische Material organisiert ist, geht auf Walter Flemming zurück und bürgerte sich in den Achtziger- und Neunzigerjahren des 19. Jahrhunderts ein. Um die Jahrhundertwende war man sich sicher, dass Chromosomen Nucleinsäuren enthalten.

Obwohl schon Anfang des 20. Jahrhunderts die Vermutung geäußert wurde, dass eine chemische Substanz wie die Nucleinsäuren für die vererbten Eigenschaften eines Organismus verantwortlich sein könnte, brachten erst die Versuche von Frederick Griffith und Oswald Avery Klarheit.

Die Rolle der DNA wurde durch die Experimente von Alfred Day Hershey und Martha Chase im Jahr 1952 bestätigt. Die beiden Forscher arbeiteten mit dem Bakteriophagen T2, der das Darmbakterium Escherichia coli befällt (Mikrobiologie).

Griffith Experimente.

Abb. 1.1a Bei der Injektion von Bakterien (Stamm S) mit extrazellulärer Schleimkapsel kommt es bei Mäusen zu einer tödlichen Infektion. b Bakterien vom Stamm R fehlt die Schleimkapsel. Infizierte Tiere überleben, da das Immunsystem die Bakterien unschädlich machen kann. c Werden Bakterien des S-Stammes durch Erhitzen abgetötet, überleben die mit den inaktivierten Bakterien infizierten Mäuse ebenfalls. d Erst wenn zu den inaktivierten Bakterien des S-Stammes lebende Bakterien des R-Stammes zugegeben werden, verläuft die Infektion tödlich.

Die Bakteriophagen bestehen aus einer Proteinhülle, die man im Experiment mit einem Schwefelisotop (35S) markieren kann. Schwefelatome kommen in Nucleinsäuren nicht vor DNA kann dagegen mit einem Phosphorisotop (32P) markiert werden. Phosphoratome fehlen wiederum in Proteinen (abgesehen von einigen seltenen Fällen in denen posttranslational Proteine phosphoryliert werden). In zwei unabhängigen Experimenten infizierten Hershey und Chase Bakterien mit den T2-Phagen, die entweder radioaktiv markiertes Protein oder radioaktiv markierte DNA enthielten. Es stellte sich heraus, dass nur die radioaktiv markierte DNA in den neu gebildeten Phagen auftauchte, nicht aber die radioaktiv markierten Proteine (▶ Abb. 1.2). Die Experimente von Frederick Griffith, Oswald Avery, A. D. Hershey und Martha Chase gelten heute als die klassischen Arbeiten, deren Ergebnisse die DNA als Träger der genetischen Information identifizierten.

Bei Eukaryoten befindet sich der Hauptanteil der DNA im Zellkern (Kerngenom, ncDNA). Vergleichsweise geringe Mengen an DNA sind in den Mitochon- drien (Mitochondriengenom, mtDNA) und den Plastiden (Plastidengenom, ptDNA) enthalten. Die Gesamtheit der in der DNA enthaltenen Information ist in Teilstücke gegliedert: die Gene. Ein Gen ist ein DNA-Abschnitt, der die Information für die geregelte Synthese eines RNA-Moleküls enthält, das anschließend entweder als Vorlage für die Synthese eines Polypeptids bzw. Proteins dient oder selbst eine Funktion in der Zelle übernehmen kann. Dieser Vorgang, bei dem die in den Genen enthaltene Information der Zelle zugänglich gemacht wird, wird als Genexpressionbezeichnet. Die in einem Gen enthaltene Information wird zuerst in RNA umgeschrieben (Transkription, Kap. ▶ 4). Stellt das RNA-Transkript nicht selbst das Endprodukt der Genexpression dar, lenkt das RNA-Molekül, dann als Messenger-RNA (mRNA) bezeichnet, an den Ribosomen die Synthese des Polypeptids, dessen Aminosäuresequenz durch die Nucleotidsequenz der RNA vorgegeben ist (Translation, Kap. ▶ 5). Bei diesen Vorgängen werden noch andere Formen der RNA benötigt: Die ribosomale RNA (rRNA), die mit Proteinen assoziiert als strukturelle Komponente der Ribosomen an der Proteinbiosynthese (Translation) beteiligt ist, sowie die Transfer-RNAs (tRNAs), die die Anlieferung von Aminosäuren und das Lesen der mRNA übernehmen. Daneben existieren im Kern (snRNA) und im Cytoplasma (scRNA) eine Reihe von kurzen RNAs. Die mit Proteinen assoziierte snRNA spielt eine Rolle beim Splicing (Spleißen). Bei der Regulation der Translation verhindert u. a. antisense-RNA über RNA-RNA-Duplexbildung das Ablesen der mRNA (sense-RNA). Bei manchen Viren ist jedoch auch RNA in einzel- und doppelsträngiger Form als Träger der Erbinformation nachgewiesen worden, so z. B. in den Retroviren Mikrobiologie).

DNA als Träger der genetischen Information.

Abb. 1.2 Nach der Infektion fand sich die gesamte radioaktiv markierte DNA in den neu gebildeten Phagen, während radioaktiv markierte Proteine nur in Spuren nachzuweisen waren. Daraus schloss man, dass die DNA das Erbmaterial darstellt, das an die nächste Generation der Phagenpartikel weitergegeben wird.

Nucleinsäuren: DNA und RNA, Polynucleotide. Speicher und Überträger der genetischen Information. Strukturelemente, können enzymatische Funktion haben.

Gen: DNA-Abschnitt, der die Information für die Synthese eines RNA-Moleküls enthält, das entweder als Vorlage für die Synthese eines Polypeptids bzw. Proteins (Translation) dient oder selbst eine Funktion in der Zelle übernimmt.

Genexpression: Vorgang, bei dem die Information der Gene über Transkription und Translation der Zelle zugänglich gemacht wird.

1.2 DNA- und RNA-Bausteine

RNA und DNA sind Polynucleotide, deren Bausteine aus einem Zuckermolekül, einer Base und einer Phosphatgruppe bestehen. Bei der DNA ist der Zuckerbestandteil 2´-Desoxyribose, bei der RNA Ribose. Die DNA enthält die Basen Adenin, Thymin, Guanin und Cytosin. Bei der RNA ersetzt Uracil das Thymin.

Grundbausteine der DNA.

Abb. 1.3a Nucleotide bestehen aus einer Pentose, einer Base und einem Phosphatrest. Die Verbindung aus Zucker und Base wird als Nucleosid bezeichnet. b Die Positionsnummern der Kohlenstoffatome im Zuckeranteil der Nucleotide werden mit einem Apostroph (´) gekennzeichnet, um sie von den Positionsnummern der Stickstoff- und Kohlenstoffatome in den Basen zu unterscheiden. Das Kohlenstoffatom in der Position 5´ ist mit der Phosphatgruppe verestert. c Strukturformeln der in den Nucleinsäuren vorkommenden Pyrimidin- und Purinbasen.

Wie die meisten biologischen Makromoleküle sind die Nucleinsäuren Polymere, die aus vielen relativ einfachen Bausteinen, den Monomeren, zusammengesetzt sind. Die Bausteine der Nucleinsäuren sind die Nucleotide. Nucleotide bestehen wiederum aus drei Komponenten, einem Zuckermolekül, einer Base und einer Phosphatgruppe (▶ Abb. 1.3). Der zentrale Bestandteil ist ein Zuckermolekülin Form eines 5-gliedrigen Ringsystems (Pentose): die 2´-Desoxyribose bzw. die Ribose (▶ Abb. 1.3b). Dabei besitzt die DNA 2´-Desoxyribose, eine Desoxypentose (▶ Abb. 1.3), der die Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom in Position 2´ fehlt. In der RNA liegt die Pentose als Ribose vor, bei der auch das Kohlenstoffatom in Position 2´ eine Hydroxylgruppe trägt ( Biochemie, Zellbiologie).

Eine kovalente Bindung vom Kohlenstoffatom in der Position 1´ des Zuckermoleküls zu einem Stickstoffatom der Base verknüpft die Basemit dem Zucker.

Diese Art der Bindung wird als N-glykosidische Bindung bezeichnet. Bei den Basen unterscheidet man zwei Typen: die Pyrimidin- und die Purinbasen. Die Pyrimidinbasenbestehen aus einem 6-gliedrigen Ringsystem. Thymin (Thy) und Cytosin (Cyt) treten in der DNA auf. Die RNA besitzt an Stelle des Thymins die Pyrimidinbase Uracil (Ura), die sich vom Thymin nur durch das Fehlen einer Methylgruppe in Position 5 unterscheidet (▶ Abb. 1.3c). Die Purinbasenbestehen aus sich überlappenden Ringsystemen mit 5 und 6 Gliedern. Adenin (Ade) und Guanin (Gua) sind die Purinbasen, die sich gleichermaßen in der DNA wie der RNA finden. Die Anfangsbuchstaben der Basen dienen als Abkürzungen für die entsprechenden Nucleoside bzw. Nucleotide. Die eben genannten Basen sind bei weitem am häufigsten in den Nucleinsäuren anzutreffen. Bei Mikroorganismen kommt sowohl in der DNA als auch in der RNA noch in geringer Menge N6-Methyladenin vor. Bei Tieren und Pflanzen tritt das 5-Methylcytosin auf. Ribosomale- und transfer-RNAs enthalten weitere methylierte Purin- und Pyrimidinbasen, die durch die Aktivität spezieller Methylasen nach dem Einbau in die Nucleinsäuren entstehen. Zur Verdeutlichung der Nomenklatur der häufig vorkommenden Nucleoside sei auf ▶ Tab. 1.1 verwiesen.

Durch Veresterung der Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom in der Position 5´ der Ribose oder Desoxyribose mit Phosphorsäurewerden die Nucleotide gebildet (▶ Abb. 1.3). Auch die Hydroxylgruppe in der Position 3´ steht für die Esterbildung zur Verfügung. In den Nucleinsäuren finden wir nur die Monophosphate der Nucleoside. Als Monomere kommen aber auch die Di- und Triphosphate der Nucleoside in der Zelle vor. Als energiereiche Verbindungen u. a. in Form von ATP stehen sie im Mittelpunkt des Energie- und Baustoffwechsels ( Botanik, Biochemie, Zellbiologie) oder als Regulatormoleküle in Form von cAMP oder ppGpp (Stringent response, Mikrobiologie). In ▶ Tab. 1.2 wird die Nomenklatur der Nucleotide in Abhängigkeit von der Position der Phosphatgruppen nur für die Base Adenin wiedergegeben. Daraus lässt sich ohne Mühe die Benennung der Cytosin-, Guanin-, Thymin- und Uracil-haltigen Nucleotide ableiten. Die Di- und Triphosphate werden analog bezeichnet. So stehen z. B. Adenosin-5´-diphosphat (5´-ADP) für das Diphosphat und Adenosin- 5´-triphosphat (5´-ATP) für das Triphosphat.

Tab. 1.1

Die Nucleoside der fünf in den Nucleinsäuren vorkommenden Basen mit ihren Abkürzungen, aufgelistet in Abhängigkeit vom enthaltenen Zuckermolekül.

Base

Zucker

Nucleosid

Cytosin (Cyt)

Ribose (RNA)

Cytidin (C)

Cytosin (Cyt)

Desoxyribose (DNA)

Desoxycytidin (dC)

Thymin (Thy)

Desoxyribose (DNA)

Desoxythymidin (dT)

Uracil (Ura)

Ribose (RNA)

Uridin (U)

Adenin (Ade)

Ribose (RNA)

Adenosin (A)

Adenin (Ade)

Desoxyribose (DNA)

Desoxyadenosin (dA)

Guanin (Gua)

Ribose (RNA)

Guanosin (G)

Guanin (Gua)

Desoxyribose (DNA)

Desoxyguanosin (dG)

Tab. 1.2

Nomenklatur der Nucleosid-Monophosphate in Abhängigkeit von der Position des veresterten C-Atoms.

Nucleosid

Position des C-Atoms mit Phosphatgruppe

Nucleotid

Abgekürzte Schreibweise

Adenosin (RNA)

5´

Adenosin-5´-monophosphat

5´-AMP

Adenosin (RNA)

3´

Adenosin-3´-monophosphat

3´-AMP

Desoxyadenosin (DNA)

5´

Desoxyadenosin-5´-monophosphat

5´-dAMP

Desoxyadenosin (DNA)

3´

Desoxyadenosin-3´-monophosphat

3´-dAMP

Pyrimidinbasen: N-haltiger, 6-gliedriger Ring; Thymin, Cytosin, Uracil.

Purinbasen: N-haltige überlappende Ringsysteme aus 5 und 6 Gliedern; Adenin, Guanin.

Nucleosid: Besteht aus Purin- oder Pyrimidinbase und Pentose (Ribose oder Desoxyribose).

Nucleotid: Besteht aus Nucleosid und Phosphatgruppe.

1.3 Bau der Nucleinsäuren

Die Nucleinsäuren RNA und DNA bilden lange kettenförmige Polymere. Sowohl RNA als auch DNA sind in der Lage unterschiedliche Konformationen einzunehmen. Die bevorzugte Konformation ist hierbei die Ausbildung einer Doppelhelix, welche in unterschiedlichen Fomen, als A-DNA, B-DNA oder Z-DNA bezeichnet, vorkommen kann. Die physiologisch vorherrschende Form der DNA ist die B-Form, während bei helikalen RNA-Strukturen die A-Form vorliegt. Die unterschiedlichen Formen der DNA haben auch biologische Bedeutung. An eine DNA-Doppelhelix kann sich ein weiterer Nucleotidstrang unter Ausbildung einer Tripelhelix anlagern. Bestimmte Guanosin-reiche Sequenz-Wiederholungen bilden viersträngige Strukturen, sogenannte G-Quadruplexe oder G-Tetraplexe aus.

1.3.1 Nucleotidketten und Basenpaarung

DNA und RNA sind Polymere aus Nucleotiden bzw. Desoxynucleotiden. Das Rückgrat dieser Nuclotidketten besteht aus alternierenden Zuckermolekülen und Phosphatgruppen (▶ Abb. 1.4). Es resultieren zwei unterschiedliche Enden, welche nach der Lage des Kohlenstoffatoms der Ribose bzw. Desoxyribose entsprechend als 3´ – oder 5´-Ende bezeichnet werden.

Die Basen der Nucleotide sind in der Lage, mit anderen Basen in Wechselwirkung zu treten. Diese Basenpaarungenwerden durch Wasserstoffbrücken-Bindungen vermittelt, welche sich zwischen Sauerstoff- bzw. Stickstoffatomen der gegenüberliegenden Basen ausbilden. Einer Purinbase steht in der Regel eine Pyrimidinbase gegenüber. Unter bestimmten Bedingungen sind aber auch andersartige Basenpaarungen, z. B. zwischen zwei Purinbasen, möglich. In der DNA liegt der Purinbase A die Pyrimidinbase T und der Purinbase G die Pyrimidinbase C gegenüber. Dies hat zur Konsequenz, dass zwei aneinander gelagerte DNA-Stränge zueinander komplementäre Sequenzen besitzen; d. h. die Stränge haben eine entgegengesetzte Basenabfolge. Die Sequenz eines Stranges determiniert somit die Sequenz des gegenläufigen Stranges (antiparallele Orientierung). Die Standard-Basenpaarungen werden nach den Wissenschaftlern, die diese Strukturen erstmals vorgeschlagen haben, auch als Watson-Crick- Basenpaarungen bezeichnet. Die Menge von A in einem DNA-Doppelstrang entspricht der von T; ebenso korreliert die Menge von C mit der von G. Diese Beziehung ist auch als Chargaff-Regelbekannt. Der AT- bzw. GC-Gehalt variiert zwischen unterschiedlichen Organismen und wird auch als Klassifizierungsmerkmal herangezogen ( ▶ Tab. 1.3). Basenpaarungen können auch innerhalb eines Nucleotidstranges vorkommen. Dies ist häufig bei RNA-Molekülen der Fall, welche durch die Ausbildung solcher intermolekularen Basenpaarungen bestimmte Sekundärstrukturen einnehmen.

Nucleotidkette.

Abb. 1.4 Das Rückgrat wird durch die Kohlenstoffatome 3´ bis 5´ der Zuckermoleküle und die Phosphatgruppen gebildet. Die Basen ragen aus dieser Kette heraus.

Tab. 1.3

Prozentualer Basengehalt der doppelsträngigen DNA verschiedener Organismen und Viren.

Aus dem wiedergegebenen AT-Gehalt der Organismen und Viren lässt sich durch Subtraktion von 100 der GC-Gehalt errechnen.

Bakteriophage T7

52,0

Escherichia coli

48,3

Sprosshefe (Saccharomyces cerevisiae)

74,3

Mais (Zea mays)

54,0

Taufliege (Drosophila melanogaster)

70,2

Mensch (Homo sapiens)

71,6

1.3.2 Die DNA-Doppelhelix

James Watson und Francis Crick, die damals an den Cavendish Laboratorien in London tätig waren, benutzen Daten aus Röntgenbeugungsexperimenten von Maurice Wilkins und Rosalind Franklin, die in London am King’s College arbeiteten, und stellten im Jahr 1953 in zwei Arbeiten in der Zeitschrift „Nature“ ein Modell der DNA und ihrer Replikation vor. Dieses Modell hat sich als richtig erwiesen und beschreibt die DNA als eine rechtsgängige Doppelhelix. Die abwechselnden Zuckermoleküle und Phosphatgruppen der Einzelstränge bilden ein außenliegendes Rückgrat, während die Basen in das Helixinnere hinein orientiert sind (▶ Abb. 1.5). Da sowohl GC- als auch AT-Paarungen jeweils eine Purinund eine Pyrimidinbase enthalten, haben sie eine sehr ähnliche Raumausfüllung. Im isolierten Zustand tritt uns die DNA als relativ uniformer Faden mit einem Durchmesser von etwa 2 nm entgegen.

Neben den eigentlichen Basenpaarungen sind auch die Wechselwirkungen zwischen aufeinanderfolgenden Basenpaaren von entscheidender Bedeutung für die Ausbildung bzw. Stabilität einer Doppelhelix. Diese hydrophoben Wechselwirkungen werden als Stacking Forces oder Stacking Interactions bezeichnet.

Die Basen der DNA sind nicht nur zur Ausbildung der nach innen gerichteten Watson-Crick-Paarungen in der Lage, sondern können über andere Wasserstoffbrücken auch an der Außenseite der Doppelhelix Basen anlagern. Diese ebenfalls spezifische Basenpaarung bezeichnet man als Hoogsteen-Wasserstoffbrücken. Es hat sich herausgestellt, dass ein G, gebunden an ein GC-Paar, und ein T, gebunden an ein AT-Paar, besonders stabil sind. Über solche Hoogsteen-Basenpaarungen kann sich ein weiterer DNA-Strang in die große Furche einer DNA-Doppelhelix unter Ausbildung einer DNA-Tripelhelix, auch als H-DNA bezeichnet, einlagern (▶ Abb. 1.5c).

Basenpaarungen.

Abb. 1.5a Wasserstoffbrücken-Bindungen sind schwache Bindungen, bei denen sich zwei Atome hoher Elektronegativität ein Wasserstoffatom teilen. Um kovalente Bindungen von den Wasserstoffbrücken zu unterscheiden, werden diese in der Regel durch gestrichelte Linien dargestellt. Im Doppelstrang stehen sich immer eine Purinbase und eine Pyrimidinbase gegenüber. Zwischen Adenin und Thymin beziehungsweise Uracil kommt es zur Ausbildung von zwei, zwischen Guanin und Cytosin zur Ausbildung von drei Wasserstoffbrücken-Bindungen (Watson-Crick-Basenpaarung). b Über Hoogsteen-Wasserstoffbrücken- Bindungen können sich auch an der Außenseite der Doppelhelix Basen anlagern, was zur Ausbildung einer Tripelhelix führt (c).

Bei den ersten kristallographischen Arbeiten mit DNA wurden zwei unterschiedliche Präparationen verwendet, welche auch unterschiedliche Röntgenstreuungsmuster lieferten. Diese unterschiedlichen Formen wurden als „kristalline“ DNA (A-Form) und als „feuchte“ DNA (B-Form) bezeichnet. Die Bezeichnungen A- bzw. B-DNA werden weiterhin verwendet. Heute ist bekannt, dass die B-Form die unter natürlichen Bedingungen überwiegende Konformation der DNA ist. Die A-Form der DNA wird durch Entzug von Wasser hervorgerufen. Beispielsweise erhält man diese Konformation beim Lösen der DNA in Ethanol. Unter natürlichen Bedingungen kommt die A-Form z. B. in den Überdauerungsformen (Sporen) bestimmter Bakterien vor, welche einen stark reduzierten Wassergehalt aufweisen. Die Strukturen beider Formen sind bekannt und unterscheiden sich in der Anzahl der Basenpaare pro Helixwindung, der Länge einer Windung und dem Durchmesser der Helix (▶ Abb. 1.6). Beide Helices bilden eine rechtsgängige Doppelhelix. Doppelsträngige RNA bildet Helices aus, welche der Konformation der A-DNA entsprechen.

DNA-Struktur.

Abb. 1.6 Sowohl die A- als auch die B-Form bilden rechtsgängige DNADoppelhelices aus. Bei der B-DNA (A-DNA) beträgt die Zahl der Basenpaare (bp) pro Windung ca. 10,5 (11). Bei einem Abstand der Basenpaare von 0,34 nm (0,26 m) resultiert somit für die Windung eine Länge von ca. 3,4 nm (2,9 nm).

An der DNA-Doppelhelix bilden sich an der Außenseite zwei Vertiefungen, welche als große bzw. kleine Furche bezeichnet werden. DNA-bindende Proteine binden in diese Furchen und können hier die DNA-Sequenz „auslesen“. Auch kleinere Moleküle können sich, mehr oder weniger selektiv, in die Furchen einlagern. Die Fluoreszenzfarbstoffe Hoechst 33 258 und Distamycin lagern sich z. B. in die kleine Furche der DNA ein. Dabei werden AT-reiche Abschnitte stark bevorzugt.

Die Zahl der Basenpaare im Genom wurde für viele Viren und Organismen wenigstens ungefähr bestimmt und ist heute ein übliches Maß für die Genomgröße. Weniger gebräuchlich ist die Angabe des DNA-Gehalts einer Zelle in Picogramm (pg) DNA. 3000 bp entsprechen 3,3 × 10–6 pg DNA. Die Beziehung zwischen Basenpaaren und der Länge eines Abschnitts der B-DNA wird oft genutzt, um eine anschauliche Längenangabe für das gesamte Genom zu errechnen ( ▶ Tab. 1.4, ▶ Tab. 1.5). Für Viren, deren Genom aus einzelsträngiger DNA besteht, gilt diese Beziehung naturgemäß nicht ( ▶ Tab. 1.4). Für größere DNA-Moleküle verwendet man die Ausdrücke Kilobasen (kb) oder Megabasen (mb), die 103 bzw. 106 Basenpaaren entsprechen.

Tab. 1.4

Genomgröße und Form der DNA in Viren und Bacteria.

Die Werte in der Spalte Nucleotide/Basenpaare geben für einzelsträngige DNA die Zahl der Nucleotide an, bei doppelsträngiger DNA die Zahl der Basenpaare. Der Beziehung zwischen der Zahl der Nucleotide/Basenpaare und der Konturlänge der Doppelhelix liegt das Verhältnis von 10,5 Basenpaaren auf 3,4 nm der DNA-Doppelhelix zu Grunde. Die Beziehung zwischen Basenpaaren und DNA-Gehalt in Picogramm (pg) basiert auf der Entsprechung 3 000 bp ((≙)) 3,3 q 10

–6

pg DNA.

Form der DNA

Nucleotide/ Basenpaare

DNA-Gehalt (pg)

Konturlänge der Doppelhelix (µm)

Simian Virus (SV40)

zirkulär, doppelsträngig

5243

5,8 × 10–6

ca.

1,7

Bakteriophage M13

zirkulär, einzelsträngig

6407

7,0 × 10–6

–

Bakteriophage Lambda

linear, doppelsträngig

48502

5,3 × 10–5

ca.

15,7

Bakteriophage T4

linear, doppelsträngig

ca.

166000

ca.

1,8 × 10–4

ca.

53,7

Escherichia coli

zirkulär, doppelsträngig

ca.

4720000

ca.

5,2 × 10–3

ca.

1528,4

Bacillus subtilis

zirkulär, doppelsträngig

ca.

4214814

ca.

4,6 × 10–3

ca.

1364,8

Thermotoga maritima

zirkulär, doppelsträngig

ca.

1860725

ca.

2,046 × 10–3

ca.

602,5

Tab. 1.5

Genomgrößen und Chromosomenzahlen in Eukaryoten.

Die angegebenen Werte gelten für das haploide Genom. Die Beziehung zwischen der Zahl der Basenpaare und der Konturlänge der DNA basiert auf dem Verhältnis von 10,5 Basenpaaren auf 3,4 nm der DNA-Doppelhelix.

Basenpaare

Konturlänge (cm)

Chromosomenzahl

Sprosshefe (Saccharomyces cerevisiae)

14 × 106

0,45

16

Fadenwurm (Caenorhabditis elegans)

80 × 106

2,5

4

Taufliege (Drosophila melanogaster)

165 × 106

5,3

4

Krallenfrosch (Xenopus laevis)

ca.

3000 × 106

97,1

18

Hausmaus (Mus musculus)

ca.

3000 × 106

97,1

20

Mensch (Homo sapiens)

ca.

3000 × 106

97,1

23

Mais (Zea mays)

ca.

5000 × 106

160,2

variabel (ca. 10)

Zwiebel (Allium cepa)

ca.

15000 × 106

485,7

8

In den 1970er Jahren, als die Synthese kurzer DNA-Sequenzen Routine wurde, gab es auch vermehrt strukturelle Untersuchungen an DNA. Hierbei ergab sich bei dem Hexamer d(CG)3 ein unerwarteter Befund. Die erhaltene Struktur unterschied sich deutlich von den bekannten Strukturen. Die Basen hatten z. B. bezüglich der Zuckerreste andere Ausrichtungen. Liegen bei der A- und B-DNA die Basen bezüglich der Ribose in der anti-Konformation (die Base zeigt vom Zuckerrest weg) vor, so wechseln sich hier die Orientierungen zwischen anti- und syn- Konformation (die Base ist zum Zuckerrest hin orientiert) ab. Eine weitere Auffälligkeit ist der Verlauf des Rückgrates der DNA-Ketten. Diese zeigen einen deutlichen Zick-Zack-förmigen Verlauf, der für diese DNA-Konformation namensgebend wurde: Z-DNA. Die Entdeckung dieser weiteren DNA-Konformation wurde zwar zur Kenntnis genommen, führte aber in der Wissenschaft eher ein Schattendasein. Erst als eine Umwandlung der DNA von der B-Form in die Z-Form gezeigt werden konnte, verstärkte dies das Interesse in Struktur und Funktion der Z-DNA (▶ Abb. 1.7). Mittlerweile ist bekannt, dass eine alternierende Abfolge von Purin- und Pyrimidin-Basen die Ausbildung der Z-DNA begünstigt. Im Gegensatz zu der B-Form ist die Z-Form thermodynamisch ungünstig, da sich die Phosphatgruppen hier sehr nahe kommen. Durch negatives Supercoiling wird die Ausbildung von Z-DNA begünstigt.

Die Identifizierung spezifischer Z-DNA-bindender Proteinebeweist, dass die Z-DNA von biologischer Bedeutung ist. Ein Beispiel für ein Z-DNA-bindendes Protein ist das E3L-Protein des Pocken-Virus. Dieses Protein trägt maßgeblich zur Pathogenität des Virus bei. Wird die Z-DNA-bindende Domäne von E3L entfernt, resultiert ein nach wie vor vermehrungsfähiges Virus, eine Infektion mit diesem ist (im Tierversuch) aber nicht mehr letal. Sequenzen, welche mutmaßlich Z-DNA Strukturen ausbilden, sind bei zahlreichen Genen im Bereich des Transkriptionsstartpunktes identifiziert worden. Z-DNA bildet zudem keine Nucleosomen. Diese und weitere Befunde lassen den Schluss zu, dass die Ausbildung der Z-Form von regulatorischer Bedeutung für die Transkription ist.

Übergang von B-DNA zu Z-DNA.

Abb. 1.7 An der Übergangsstelle sind zwei Basen nach außen geklappt. Der Verlauf des Rückgrats der Nucleotidketten ist eingezeichnet. Der Zick-Zackförmige Verlauf ist bei der Z-DNA deutlich zu erkennen. Im Gegensatz zur B-DNA bildet die Z-DNA eine linksgängige Helix aus und besitzt einen kleineren Durchmesser (pdb: 2ACJ).

1.3.3 Die Quadruplex-DNA

Die DNA ist ein flexibles und vielseitiges Molekül, was z. B. durch die unterschiedlichen Konformationsmöglichkeiten zum Ausdruck kommt. Guanosin-reiche DNA kann eine viersträngige Helixbilden. Vier Guanin-Basen liegen hierbei in einer Ebene und sind über Wasserstoffbrücken-Bindungen miteinander verbunden. Diese DNA-Struktur wird daher als G-Quadruplex oder G-Tetraplex bezeichnet. Diese Strukturen können sich innerhalb eines Stranges oder auch zwischen unterschiedlichen Strängen ausbilden (▶ Abb. 1.8).

DNA-Quadruplex-Strukturen sind in der Natur weit verbreitet und üben wichtige Funktionen aus. Die 3´-Enden der linearen DNA eukaryotischer Zellen besitzen spezielle Sequenzen, die Telomere . Diese bestehen aus Tandem- Wiederholungen mehrerer hundert bis tausend G-reicher Sequenzen, beim Menschen z. B. (GGGTTA)n. Diese Sequenzen bilden spontan Quadruplex- Strukturen aus und legen die Vermutung nahe, dass die Telomere der Chromosomen ebenso in dieser Konformation vorliegen. Die Ausbildung besonderer Strukturen der DNA-Enden ist für die Zellen von entscheidender Bedeutung, erlaubt dies doch die Unterscheidung zwischen dem normalen Ende eines Chromosoms und dem aus einem DNA-Bruch entstandenen Ende. Somit wird eine Verknüpfung der einzelnenen Chromosomen durch die DNA-Reparaturenzyme verhindert.

Quadruplex-DNA.

Abb. 1.8a Die sich wiederholende Sequenz (GGGTTA)4 bildet eine viersträngige Quadruplex-Struktur aus. Der Verlauf des DNA-Rückgrates ist eingezeichnet. In der Mitte befindet sich meist ein Kaliumion (pdb: 143D). b Beispiele für unterschiedliche Möglichkeiten zur Ausbildung von Quadruplex-Strukturen. Die DNA-Stränge können hierbei parallel oder auch antiparallel zueinander orientiert sein.

Quadruplex-Strukturen bilden sich aber nicht nur an den Telomeren, sondern auch an anderen Bereichen aus. Interessanterweise wurden solche DNA-Sequenzen in den Promotorbereichen von z. B. den Protooncogenen c-myc oder VEGF (vascular endothelial growth factor) gefunden. Die Ausbildungen der Quadruplex- Strukturen verhindern die Transkription der entsprechenden Gene.

Die Kentnisse über die strukturelle Bedeutung der DNA haben zu neuartigen Ansätzen in der Entwicklung von Therapeutikageführt. Der Angriffspunkt bei diesen Strategien ist hierbei die DNA an definierten Stellen. Eine Strategie verfolgt die Fähigkeit von DNA, dreisträngige Helicesauszubilden. Synthetische Oligonucleotide können sequenzspezifisch mit der DNA interferieren und hierdurch die Genexpression bzw. Replikation verhindern. Die andere Strategie verfolgt die Entwicklung spezifischer G-Quadruplex bindender Substanzen. Diese Substanzen stabilisieren die G-Quadruplex-Strukturen. Hierdurch wird z. B. die Funktion der Telomerase, welche für die Verlängerung der Telomere zuständig ist, verhindert. Telomerase ist in vielen Krebsarten dereguliert und ständig aktiv. Ein weiteres Ziel ist die selektive Unterdrückung der Transkription bestimmter Protoonkogene. Eine natürliche vorkommende G-Quadruplex-bindende Substanz ist z. B. das von Streptomyces anulatus gebildete Telomestatin. Erste G-Quadruplex-bindende Substanzen befinden sich in der klinischen Versuchsphase zur Behandlung bestimmter Krebsformen.

Watson-Crick-Basenpaarung: Basenpaarung zwischen komplementären DNASträngen, bewirkt Ausbildung einer rechtsgängigen Doppelhelix, beruht auf Wasserstoffbrücken-Bindungen zwischen einer Purinbase und einer Pyrimidinbase. Zwei Bindungen zwischen A (Purin) und T (Pyrimidin), drei Bindungen zwischen G (Purin) und C (Pyrimidin). Mengenverhältnis von A zu T oder G zu C ist 1 (Chargaff-Regel).

A-DNA: Konformation der DNA-Doppelhelix bei Wasserentzug. Unter natürlichen Bedingungen bisher nur bei Sporen gefunden. Enthält 11 bp pro Windung, Länge der Windung 2,9 nm.

B-DNA: Konformation einer DNA-Doppelhelix unter physiologischen Bedingungen. Enthält 10,5 bp pro Windung, Länge der Windung beträgt 3,4 nm, bildet zwei Vertiefungen aus: große und kleine Furche.

Z-DNA: Lingsgängige DNA-Doppelhelix. Die Ausbildung der Z-DNA wird – zumindest bei Eukaryoten – zu regulatorischen Zwecken genutzt.

H-DNA: Tripelhelikale DNA. Entsteht durch Anlagerung eines weiteren DNA-Stranges in die große Furche. Ausbildung von Hoogsteen-Basenpaarungen zu den Basen der Duplex-DNA.

Hoogsteen-Wasserstoffbrücken: Ausbildung von Wasserstoffbrücken an der Außenseite der Doppelhelix. Führt zur Ausbildung eines dritten DNA-Stranges meist aus G und T (DNA-Tripelhelix).

G-Quadruplex (G-Tetraplex): Viersträngige DNA, welche von Guanosin-reichen Abschnitten gebildet werden kann. Kommt vor allem in den Telomeren und bestimmten Promotor-Regionen bei Eukaryoten vor.

1.4 Eigenschaften der Nucleinsäuren

Aufgrund ihrer Struktur besitzen Nucleinsäuren einige besondere Eigenschaften. Dazu gehört das unterschiedliche Absorptionsverhalten von ultraviolettem Licht bei einzel- bzw. doppelsträngigen DNA- und RNA-Molekülen, die künstlich durch physikalische oder chemische Faktoren induzierbare De- bzw. Renaturierung von doppelsträngigen Nucleinsäuren, die Grundlage vieler genetischer Methoden ist, und die Ausbildung von besonderen Sekundärstrukturen wie Haarnadelschleifen. Bei ringförmigen DNA-Molekülen ergeben sich topologische Besonderheiten.

1.4.1 Absorption von ultraviolettem Licht

Aufgrund des aromatischen Charakters der Basen absorbieren Nucleinsäuren ultraviolettes Licht. Die Zuckerreste und die Phosphatgruppen der Nucleotidketten tragen nicht merklich zur Absorption bei. Die maximale Absorption der DNA und der RNA liegt bei 260 nm (▶ Abb. 1.9); man bezeichnet sie daher als A260. Die Absorption ist für einzeln vorliegende Nucleotide am größten, erreicht ein mittleres Niveau für einzelsträngige DNA und ist am geringsten für doppelsträngige DNA. Die zunehmend engere Nachbarschaft der Basen in der DNA-Doppelhelix im Vergleich zu einzelsträngiger DNA führt zur Abnahme der Absorption, die als Hypochromie bezeichnet wird. Doppelsträngige DNA ist also hypochrom im Vergleich zu einzelsträngiger DNA und RNA. Die OLE_LINK1»OLE_LINK2»A260 einzelsträngiger RNA ist um 37 % höher als die doppelsträngiger DNA (▶ Abb. 1.9). Die Absorption der DNA wird auch genutzt, um die DNA-Konzentration in einer Lösung anzugeben. Eine Lösung mit 1 mg ml–1 doppelsträngiger DNA hat eine A260 von 20. Der entsprechende Wert für einzelsträngige DNA und RNA ist etwa 25. Diese Werte werden aber etwas von der Basenzusammensetzung beeinflusst, da Purinbasen eine höhere Absorption besitzen als Pyrimidinbasen.

A260.

Abb. 1.9 Das Absorptionsverhalten verschiedener Nucleinsäuren im ultravioletten Licht zeichnet sich durch ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von 260 nm aus. Doppelsträngige DNA ist hypochrom zur RNA.

1.4.2 Schmelzen und Renaturierung der DNA

Erhöht man die Temperatur einer DNA-haltigen Lösung, werden die Wasserstoffbrücken- Bindungen zerstört und die beiden Stränge trennen sich voneinander zu Einzelstrang-DNA. Mit zunehmender Temperatur entstehen immer mehr einzelsträngige Bereiche. Dabei nimmt wegen der oben beschriebenen Hypochromie die Absorption von kurzwelligem Licht in der Lösung zu. Wenn A260 gegen die Temperatur aufgetragen wird, erhält man eine Schmelzkurveder DNA. Als Schmelzpunkt der DNA (Tm) bezeichnet man die Temperatur, bei der das Maximum von A260 gerade zur Hälfte erreicht ist (▶ Abb. 1.10). Tm steigt mit zunehmendem GC-Gehalt an, da GC-Paare wegen der sie verbindenden drei Wasserstoffbrücken- Bindungen schwerer zu trennen sind als AT-Paare. Die Herstellung einzelsträngiger DNA wird auch als Denaturierung bezeichnet. Dies kann durch erhöhte Temperatur oder der Zugabe bestimmter Chemikalien wie Harnstoff (H2NCONH2) oder Formamid (HCONH2) erreicht werden.

Schmelzkurve.

Abb. 1.10 Mit zunehmender Temperatur treten immer mehr einzelsträngige DNA-Abschnitte auf. Die Absorption bei 260 nm erhöht sich. Wenn nur noch einzelsträngige DNA-Abschnitte vorliegen, steigt die Absorption nicht mehr weiter an. Der Schmelzpunkt Tm der DNA liegt bei der halbmaximalen Absorption der Einzelstrang-DNA.

Bei der Renaturierung, auch als Reassoziation oder Annealing bezechnet, lagern sich die komplementären DNA-Stränge wieder aneinander. Dieser Prozess kann durch die Wahl der Pufferbedingungen (pH-Wert bzw. Salzkonzentration), vor allem aber der Temperatur beeinflusst werden. Meist erfolgt die Renaturierung bei einer Temperatur etwa 20 °C unterhalb von Tm. Die Wahl der richtigen Annealing-Temperatur ist ein wichtiger Parameter bei der PCR. Nach vollständiger Renaturierung hat die DNA wieder den ursprünglichen Schmelzpunkt. Fehlpaarungen (mismatches) zwischen den beiden komplementären Strängen äußern sich in einer erniedrigten Schmelztemperatur. Wenn in Experimenten zur Renaturierung ausreichend komplementäre einzelsträngige DNA aus einer anderen Stelle desselben Genoms oder von einer anderen Spezies eingesetzt wird, spricht man von Hybridisierung. Unter geeigneten Bedingungen können auch stabile DNA-RNA-Hybride gebildet werden. Die Bedingungen bei einer Hybridisierungsreaktion werden unter dem Begriff Stringenz (stringency) zusammengefasst. Wenn die Stringenz hoch ist, d. h. bei einer Temperatur von etwa 42 °C und hohen Formamidkonzentrationen (z. B. 50 %), werden die DNAProben nur bei perfekter Komplementarität hybridisieren. Bei niedriger Stringenz, d. h. in Anwesenheit von z. B. 35 % Formamid, wird dagegen eine größere Zahl von Fehlpaarungen toleriert. Wenn die beiden zu hybridisierenden DNAProben völlig komplementär sind, wird man unter Bedingungen von hoher Stringenz hybridisieren, um den Hintergrund an Fehlpaarungen niedrig zu halten. Hybridisierung bei geringer Stringenz ist zu empfehlen, wenn der Grad der Komplementarität der beiden DNA-Proben nicht bekannt ist. Mithilfe der Hybridisierung können experimentell komplementäre DNA-Sequenzen nachgewiesen werden, wenn man einen der Reaktionspartner radioaktiv oder durch Einbau einer fluoreszierenden Verbindung markiert hat. Dieser Reaktionspartner einer Hybridisierungsreaktion wird als Sonde bezeichnet.

1.4.3 Haarnadelschleife

Es gibt in der DNA Konformationen, die an das Vorliegen bestimmter DNA-Sequenzen gebunden sind. Tritt eine beliebige Basensequenz zwei Mal in umgekehrter Orientierung in einiger Entfernung voneinander in einem DNA-Doppelstrang auf, spricht man von einem Inverted Repeat. Ein Palindrom ist ein Spezialfall des Inverted Repeat, bei dem zwei identische Basensequenzen, eine davon in umgekehrter Orientierung, sehr nahe hintereinander auftreten, also kreuzspiegelsymmetrisch in Bezug auf die Einzelstränge oder komplementär sind (▶ Abb. 1.11). Solche Sequenzwiederholungen sind im Genom nicht ungewöhnlich, und in beiden Fällen kann sich dann durch Paarung der komplementären Basen eine Haarnadelschleife (hairpin loop, stem loop) bilden. Es entsteht eine kreuzförmige DNA. In entspannter DNA ist diese Konformation energetisch allerdings ungünstig.

Palindrom.

Abb. 1.11 In diesem DNA-Element ist dieselbe DNA-Sequenz in umgekehrter Orientierung, nur von drei Basenpaaren getrennt, hintereinander angeordnet. Unter dieser Voraussetzung ist eine kreuzförmige Konformation zwar möglich, aber energetisch ungünstig.

Topologie.

Abb. 1.12a TEM-Aufnahme von gespreiteten Plasmiden (pBR322 aus Escherichia coli). Neben einem entspannten Ring (großer Pfeil) liegen zwei superhelikal gewundene Plasmide vor (kleine Pfeile). (Foto von D. Kapp, Bielefeld.) b Eine doppelsträngige ringförmige DNA wird um zwei Windungen entwunden. Um sich zu stabilisieren, nimmt das Molekül eine superhelikale Konformation ein.

Die Enzyme, die für die Bildung der topoisomeren Formen verantwortlich sind, bezeichnet man als Topoisomerasen. Topoisomerasen sind essentiell für die Veränderung der Topologie der DNA und daher Angriffspunkt für Antibiotika und Cytostatika. Die eben geschilderte Herstellung eines superhelikal gewundenen DNA-Rings wird von der Topoisomerase I vermittelt. Sie vermag einen der beiden Stränge einer doppelsträngigen DNA auf der Höhe der Phosphodiesterbindung zu durchtrennen, den intakten Strang durch diese Lücke hindurchzuführen und die Enden wieder miteinander zu verbinden. Die Topoisomerase II, auf die bei der Besprechung der Struktur eukaryotischer Chromosomen noch einmal eingegangen wird, ist in der Lage, doppelsträngige DNA zu zerschneiden, einen anderen DNA-Doppelstrang durch den Spalt zu führen und die Lücke wieder zu schließen; diese Reaktion ist ATP-abhängig.

Die Topologie von negativ superhelikal gewundenen DNA-Ringen kann von außen durch die Temperatur und die Ionenstärke der Lösung beeinflusst werden. Wichtiger ist aber der Einfluss von sogenannten interkalierenden Verbindungen. Das bekannteste Beispiel dafür ist das Ethidiumbromid. Der polyzyklische Aromat lagert sich zwischen die Basenpaare ein (Interkalation). Dabei nimmt die UV-induzierte Fluoreszenz des Ethidiumbromids dramatisch zu. Wegen dieser Eigenschaft benutzt man Ethidiumbromid zum Anfärben von DNA in Gelen. In Folge der Einlagerung von Ethidiumbromid in die DNA werden negativ superhelikal aufgewundene Ringe in die entspannte Ringform übergeführt. Bei weiterer Erhöhung der Konzentration an Ethidiumbromid entstehen dann im Gegensinn (positiv) superhelikal aufgewundene DNA-Ringe.

Hypochromie: Absorptionsverhalten von Nucleinsäuren bei 260 nm. Maximale Absorption nimmt von Nucleotiden, über RNA, einzelsträngige DNA bis zur doppelsträngigen DNA ab.

Denaturierung: Zunehmende Auflösung der Wasserstoffbrücken zwischen den Strängen der Doppelhelix mit steigender Temperatur, wird über zunehmende Absorption bei 260 nm (A260) gemessen, kann in Form einer Schmelzkurve dargestellt werden. Schmelzpunkt (Tm): bezeichnet Temperatur, bei der A260 halbmaximal ist. Tm steigt mit zunehmendem GC-Gehalt. Kann auch durch Chemikalien wie Harnstoff und Formamid bewirkt werden, umkehrbar (Renaturierung, Reassoziation).

Hybridisierung: Form der Renaturierung. DNA-Einzelstränge sind unterschiedlicher Herkunft. Es können auch DNA-RNA-Hybride ausgebildet werden.

Stringenz: Experimentelle Bedingungen, die die Ausbildung eines stabilen DNADNA-, DNA-RNA- oder RNA-RNA-Hybridmoleküls erlauben. Variierbare Parameter: Temperatur während der Hybridisierung, Temperatur während des Waschvorgangs, Salzkonzentration des Waschpuffers. Je niedriger die Stringenz, desto mehr Fehlpaarungen im Hybridmolekül, je höher die Stringenz, desto weniger Fehlpaarungen werden toleriert.

Inverted Repeat: Identische Basensequenzen, die in einiger Entfernung voneinander und in umgekehrter Orientierung zueinander in einem DNA-Doppelstrang auftreten.

Palindrom: Identische Basensequenzen, die in umgekehrter Orientierung sehr nahe hintereinander in einem DNA-Doppelstrang auftreten. Basensequenzen bilden so eine kreuzspiegelsymmetrische Anordnung bzw. sind zueinander komplementär. Durch Paarung der komplementären Basen kann eine Haarnadelschleife entstehen.

Haarnadelscheife (hairpin loop, stem loop): Kreuzförmige DNA-Struktur, entsteht durch Basenpaarung zwischen komplementären DNA-Sequenzen innerhalb eines DNA-Stranges. In entspannter DNA energetisch ungünstige Konformation.

1.5 Organisation der prokaryotischen Chromosomen

Viele Archaea und Bacteria enthalten ein ringförmiges Chromosom, das in einem abgegrenzten Bereich der Zelle, dem Nucleoid, vorliegt. Prokaryotische Chromosomen sind sehr viel länger als die Zellen und müssen daher stark kompaktiert werden. Dies geschieht durch generelle DNA-Bindeproteine, die klein und positiv geladen sind und daher als „histon-ähnliche Proteine“ bezeichnet werden. Viele archaeale Arten enthalten Histone, die homolog zu eukaryotischen Histonen sind.

1.5.1 Organisation der Genome von Bakterien

Mit einer Länge von knapp 1,6 mm ist das ringförmig vorliegende doppelsträngige DNA-Molekül, auch als Bacteria-Chromosombezeichnet, des Darmbakteriums Escherichia coli, ungefähr tausendmal länger als die Bakterienzelle selbst. Die meisten Bakterienarten besitzen, wie E. coli, ein zirkuläres Chromosom, dessen Größe artspezifisch von etwa 1/6 bis zu der dreifachen Größe des E. coli- Chromosoms variieren kann. Allerdings kommen in einigen Gruppen auch lineare Chromosomen vor (z. B. Streptomyceten). Außerdem besitzen einige Arten zwei oder mehr Chromosomen unterschiedlicher Größe (z. B. Vibrio).

Die DNA liegt in Bakterien als dicht gepacktes Knäuel in der Zelle vor, wobei elektronenmikroskopische Aufnahmen von E. coli zeigen, dass dieses Knäuel in einer räumlich begrenzten Struktur lokalisiert ist, die bis zur Hälfte des Zellvolumens einnimmt und als Nucleoidbezeichnet wird (▶ Abb. 1.13a). Die chromosomale DNA ist superhelikal aufgewunden und in 50–100 Schleifendomänen organisiert. Die DNA liegt in geordneter Form in der Zelle vor, so befinden sich in einer neugeborenen Zelle der Replikationsursprung und der -terminus an den beiden entgegengesetzten Polen der Zelle. Im Verlauf des Zellzyklus findet eine Umorientierung des Chromosoms statt. Der Replikationsursprung wird zur Zellmitte transportiert, wo die Replikation an einem stationären „Replisom“ stattfindet. Nach der Replikation werden die neu replizierten Chromosombereiche aktiv zu den beiden entgegengesetzten Zellpolen transportiert, wobei der Mechanismus noch ungeklärt ist.

Wie bei den Eukaryoten auch, sind zahlreiche Proteine mit der DNA assoziiert (▶ Abb. 1.13b). Generelle DNA-Bindeproteine von Bakterien werden als „histon-ähnliche Proteine“ bezeichnet, da sie zwar keine Homologie zu eukaryotischen Histonen haben, aber wie diese auch kleine Proteine mit einem Überschuss positiv geladener Aminosäuren sind und daher gut mit der negativ geladenen DNA in Wechselwirkung treten können. Zu den nucleoid-strukturierenden Proteinen von E. coli gehören u. a. H-NS (histone-like nucleoid-structuring proteins) und HU (heat unstable nucleoid protein) ( Mikrobiologie). Bakterielle generelle DNA-Bindeproteine ermöglichen eine dynamische Verpackung, sodass die Expression der Gene trotz der kompakten Struktur möglich ist.

Die Verpackung der DNA ist nicht konstant und unterscheidet sich z. B. in Abhängigkeit von der Wachstumsphase. So enthalten exponentiell wachsende Zellen von E. coli hauptsächlich drei generelle DNA-Bindeproteine (HU, HfQ, Fis) mit jeweils ca. 50 000 Kopien je Zelle. In der stationären Phase wird die intrazelluläre Konzentration dieser drei Proteine reduziert. Dafür wird ein anderes DNA-Bindeprotein Dps („DNA-binding protein of starved cells“), stark induziert. In exponentiell wachsenden Zellen sind nur ca. 5000 Dps-Moleküle vorhanden, in der stationären Phase steigt die Kopienzahl auf fast 200 000.

Viele Bakterienarten sind in der Lage, bei Nahrungsmangel spezifische Überdauerungsformen wie Sporen auszubilden ( Mikrobiologie). Die Verpackung des Genoms in Sporen unterscheidet sich von dem in vegetativen Zellen, es werden sporenspezifische DNA-Bindeproteine gebildet, die zu einer wesentlich stärkeren Kompaktierung führen.

Organisation des bakteriellen Nucleoids.

Abb. 1.13a Das Nucleoid mit der chromosomalen DNA ist an der hellen Kontrastierung in der etwa 2 µm langen E. coli-Zelle zu erkennen (EM-Aufnahme von M. Rohde, Braunschweig). b Die chromosomale DNA ist in superhelikale Schleifen organisiert und mit zahlreichen Proteinen assoziiert. Noch vor dem Abschluss der Transkription beginnt an den entstehenden mRNAs die Translation.

1.5.2 Organisation der Genome von Archaea

Die Chromosomenaller bislang charakterisierten Archaeasind zirkulär. Viele Arten enthalten ein Chromosom, einige Arten zwei oder mehr Chromosomen. Die Größen liegen in demselben Bereich wie die bakterieller Chromosomen, sodass auch archaeale Chromosomen sehr viel länger als die Zelle sind und eine starke Kompaktierung der DNA notwendig ist.

Viele archaeale Arten enthalten Histone, die homolog zu eukaryotischen Histonen sind. Daher wird angenommen, dass schon der letzte gemeinsame Vorfahr von Archaea und Eukarya ein Histongen besessen hat. Wie bei anderen biologischen Prozessen, in die bei Archaea und Eukarya homologe Proteine involviert sind (z. B. Transkription, Replikation), spiegeln auch bei der DNA-Kompaktierung die Archaea eine ursprünglichere Version wider, während die Eukarya den Prozess weiterentwickelt haben. Dies sieht man z. B. an der Zahl der unterschiedlichen Histone, die in beiden Organismengruppen vorkommen: Die Genome der Archaea enthalten nur ein (bis zwei) unterschiedliche Histongene, während die Eukarya fünf unterschiedliche Histone enthalten. Außerdem sind die Nucleosomen der Archaea aus vier Untereinheiten aufgebaut und binden ca. 80 nt DNA, während die eukaryotischen Nucleosomen aus acht Untereinheiten bestehen und ca. 150 nt DNA binden. Die Histone der Eukarya sind größer und enthalten zusätzliche Sequenzen, die differentiell posttranslational acetyliert werden können und für die Regulation der Kompaktierung und damit auch der Genexpression wichtig sind. Es gibt jedoch Hinweise, dass auch archaeale Histone an Lysinen im konservierten Histonbereich differentiell acetyliert werden können und daher diese Form der Regulation der Kompaktierung evolutionär sehr alt ist. Allerdings können eukaryotische Histone über die Acetylierung hinaus auf vielfältige Weise posttranslational modifiziert werden (Methylierung, Phosphorylierung, ADP-Ribosylierung, Ubiquitinierung).

Nicht alle archaealen Genome enthalten Histongene. Es wurden in verschiedenen Arten eine Reihe von „histon-ähnlichen“ generellen DNA-Bindeproteinen entdeckt, ähnlich wie in Bakterien. Von einem Protein namens ALBA wurde gezeigt, dass es differentiell acetyliert werden kann und dass der Acetylierungsgrad die Affinität der DNA-Bindung beeinflusst. Die Acetylierung von Lysinen, die zur Maskierung der positiven Ladung führt, wird daher von Archaea zur differentiellen Kontrolle unterschiedlicher genereller DNA-Verpackungsproteine eingesetzt.

Dynamische intrazelluläre Lokalisation von DNA.

Abb. 1.14 Kulturen des halophilen Archaeons Halobacterium salinarum können synchronisiert werden und alle Zellen durchlaufen dann gleichzeitig den Zellzyklus. Zu verschiedenen Zeiten des Zellzyklus wurden Proben entnommen, die Zellen fixiert und die DNA mit einem blauen Fluoreszenzfarbstoff angefärbt. Die Abbildungen zeigen Überlagerungen von mikroskopischen Bildern (Zelle) und fluoreszenzmikroskopischen Bildern (DNA). Die drei Abbildungen verdeutlichen, dass die DNA zunächst in der Zelle verteilt ist (a), danach in der Zellmitte konzentriert wird (vermutlich um dort repliziert zu werden) (b), und anschließend an die beiden Zellpole transportiert wird (c). Danach wird in der DNA-freien Zellmitte ein Septum gebildet.

Wie bei Bakterien ist auch bei Archaea die intrazelluläre Lokalisation des Chromosoms nicht konstant, sondern variiert im Verlauf des Zellzyklus (▶ Abb. 1.14).

Generelle DNA-Bindeproteine: Chromosomen-assoziierte Proteine der Bacteria, sind in ihrer Funktion teilweise den eukaryotischen Histonen ähnlich. Viele Archaea enthalten „echte“ Histone, die homolog zu den eukaryotischen Histonen sind. Arten ohne Histone enthalten „histonähnliche“ DNA-Bindeproteine, ähnlich wie Bakterien.

Nucleosomen: Die archaealen Nucleosomen sind Tetramere aus einem oder zwei unterschiedlichen Histonen, im Gegensatz zu den eukaryotischen Nucleosomen (Oktamere aus vier unterschiedlichen Histonen)

Reversible Acetylierung: Bei bislang einem Histon und einem histon-ähnlichen DNA-Bindeprotein ist eine reversible Acetylierung nachgewiesen worden (vgl. reversible Histonacetylierung bei Eukaryoten).

1.6 Bau eukaryotischer Chromosomen

Bei den Eukaryoten bilden die Histone den Hauptbestandteil der chromosomalen Proteine. Dabei unterscheidet man die vier Core-Histone (H2A, H2B, H3 und H4) von dem sogenannten Linker-Histon (H1). Die mit der DNA assoziierten Proteine sind für die Verpackung der DNA im Zellkern und den Aufbau bestimmter Funktionsdomänen der Chromosomen wichtig. Jedes Chromosom besitzt bestimmte Funktionselemente: Centromere und Telomere. Sie spielen eine wichtige Rolle bei der Weitergabe der Chromosomen im Zellzyklus bzw. bei der Replikation. Daneben existieren weitere Funktionselemente wie die Nucleolus-organisierenden Regionen mancher Chromosomen, die tandemartig die Gene für ribosomale RNA enthalten.

Im Vergleich zur Größe eines Zellkerns sind die Kern-DNA-Fäden eukaryotischer Zellen extrem lang. Gerade für die geordnete Trennung des genetischen Materials in der Mitose ( Biochemie, Zellbiologie) ist es wegen der dabei auftretenden mechanischen Beanspruchung wichtig, dass die DNA-Fäden in höchst kompakter Form vorliegen. Diese Pakete genetischen Materials sind die Chromosomen, und der Verkürzungsfaktor der DNA-Fäden in den Chromosomen beträgt etwa 1 zu 12 000. Mit Ausnahme der Dinoflagellaten, bei denen bestimmte chromosomale Proteine fehlen, sind die mitotischen Chromosomen der Eukaryoten höchstwahrscheinlich einheitlich aufgebaut. Man geht davon aus, dass in jedem Chromosom ein durchgehender DNA-Faden vorliegt. Die kompakte Form der Chromosomen wird in vier Organisationsstufen erreicht, die im Folgenden vorgestellt werden und als Primär-, Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur bezeichnet werden. Zu beachten ist, dass die Chromosomen während der Meiose vorübergehend eine andere Struktur annehmen.

1.6.1 10-nm-Faden (Primärstruktur)

In den Chromosomen liegt die DNA nicht in nackter Form vor, sondern sie ist mit bestimmten Proteinen und in kleineren Mengen mit RNA assoziiert. Die DNA und die mit ihr assoziierten chromosomalen Proteine werden zusammen mit der RNA als Chromatinbezeichnet. Wir unterscheiden zwei Klassen von chromosomalen Proteinen: die mengenmäßig überwiegenden Histone, die für die Verpackung der DNA zuständig sind, und die Nicht-Histon-Proteine, die ein chromosomales Gerüst bilden und für die Organisation von Funktionsdomänen im Chromosom verantwortlich sind. Bei der Verpackung der DNA im Zellkern sind vier Organisationsstufen zu unterscheiden. Die unterste Verpackungsstufe besteht in der Ausbildung der Nucleosomen und führt zu einem 10-nm-Faden. Auf dieser Stufe wird ein Verkürzungsfaktor des DNA-Doppelstrangs von sechs bis sieben erzielt. Ein Nucleosom besteht aus einem bestimmten Abschnitt Kern- DNA, der um ein Aggregat aus acht Histon-Proteinen gewickelt ist (▶ Abb. 1.15). Diese Histone bezeichnet man auch als Core-Histone und das Aggregat als Histonoktamer. Nucleosomen enthalten weiterhin einen außerhalb der Core-Histone liegenden DNA-Abschnitt und ein weiteres Histonmolekül, das Linker-Histon H1 (▶ Abb. 1.15).

Die Beziehung zwischen den Histonen und der DNA wurde indirekt durch enzymatischen DNA-Abbau („Verdauung“) mit Micrococcus-Nuclease an isoliertem Chromatin ermittelt. Nach längerer Einwirkung des Enzyms findet man DNA-Fragmente von 146 bp Länge. Die DNA ist hier in 1,75 Windungen um das Histonoktamer geschlungen (▶ Abb. 1.15). Hierdurch ist sie vor dem Abbau durch das Enzym geschützt. Kurze Inkubation mit der Micrococcus-Nuclease liefert DNA-Fragmente, die durchschnittlich 200 bp lang sind. Dies bedeutet, dass auch relativ gut zugängliche DNA im Chromatin vorliegen muss. Diese ist zwischen den Histonoktameren angeordnet. Der Ausdruck Linker-DNA hat sich für diese freiliegende DNA eingebürgert. Die Länge der Linker-DNA ist nicht einheitlich. Sie variiert sowohl innerhalb der Zellen eines Organismus als auch zwischen verschiedenen Organismen. Werte von 0 bis 80 bp wurden ermittelt.

Es gibt vier verschiedene Core-Histone, die als H2A, H2B, H3 und H4 bezeichnet werden. Alle vier Core-Histone sind im Nucleosom zweimal vertreten und bilden das Histonoktamer, wobei einem zentralen H3-H4-Tetramer auf beiden Seiten je ein H2A-H2B-Dimer angelagert ist. Die Histone haben zwei auffällige Eigenschaften. Sie besitzen einen relativ hohen Anteil (zusammen über 20 %) an den basischen Aminosäuren Arginin und Lysin ( ▶ Tab. 1.6), durch deren positive Ladungen die negativen Ladungen der DNA, die den Core-Histonen eng anliegt, neutralisiert werden (▶ Abb. 1.15). Weiterhin sind die vier Core-Histone in ihrer Molekülgröße und Aminosäurenzusammensetzung in der Evolution außerordentlich konserviert. Histon H4 unterscheidet sich z. B. beim Rind und bei der Erbse nur durch eine einzige Aminosäure. Histon H1 ist etwas variabler: In Erythrocyten des Huhns findet sich eine Variante des Linker-Histons, für die man die Bezeichnung Histon H5 gewählt hat. Durch Modifikationen der Histone wird deren Bindung an die DNA moduliert. Dies ist von entscheidender Bedeutung im Rahmen der Transkription.

Tab. 1.6

Charakteristika der Histone bei Säugetieren.

Histon

Zahl der Aminosäuren

Anteil Arginin (%)

Anteil Lysin (%)

H2A

129

9

11

H2B

125

6

16

H3

135

13

10

H4

102

14

11

H1

215

1

29

Organisationsstufen des eukaryotischen Chromosoms.

Abb. 1.15 DNA-Doppelhelix als 2-nm-Faden. Nucleosom: Die Anordnung von Core-Histonen (Histonoktamer), Histon H1 und der DNA im 10-nm-Faden. Solenoid: Bei steigender Ionenstärke in der Lösung bilden die Nucleosomen eine Überstruktur aus. Es ist eine Superhelix mit nur kleinen Unregelmäßigkeiten, bei der das Histon H1 im Innenraum zu liegen kommt. Chromatinschleifen: Sie werden vom 30-nm-Faden ausgebildet. Sie lagern sich zu mehreren in einer Ebene an (Rosette) und sind in der Mitte über spezifische DNA-Bereiche an ein Proteingerüst gebunden. Rosette: Die Anordnung zahlreicher Rosetten hintereinander führt zu einem 300-nm-Faden. Chromatide: Der 300-nm-Faden ist helikal zur Chromatide aufgewunden. In jeder Chromatidenwindung sind etwa 30 Rosetten enthalten. Chromosom: Es wird von zwei durch Replikation entstandenen Schwesterchromatiden gebildet.

1.6.2 30-nm-Faden (Sekundärstruktur)

Man war bis vor Kurzem der Auffassung, dass das Histon H1 für die weitere Verpackung der DNA im Zellkern unverzichtbar ist. Experimente mit Tetrahymena, einem Vertreter der Protozoa, zeigten jedoch, dass Histon H1 entfernt werden kann (Knock-out-Experiment), ohne dass der Kernaufbau sichtbar leidet oder das Überleben der Zellen gefährdet ist. Histon H1 scheint eine sehr subtile Rolle als Aktivator und Suppressor der Transkription zu spielen.

Bei Erhöhung der Ionenstärke lässt sich der 10-nm-Faden in eine höhere Organisationsstruktur, den 30-nm-Faden, überführen. Dessen Aufbau ist noch nicht endgültig geklärt. Die meisten Forscher befürworten ein Modell, das eine relativ regelmäßige superhelikale Anordnung, ein Solenoid, vorsieht (▶ Abb. 1.15). Die Ausbildung eines Solenoids ist aber nicht unumstritten. Zweifel ergeben sich hauptsächlich aus der Beobachtung, dass die Linker-DNA unterschiedlich lang sein kann (s. o.). Lässt man diese Unregelmäßigkeiten in der Struktur des 10-nm- Fadens stärker in die Modellbildung einfließen, kommt man zu einer eher unregelmäßigen Struktur mit lokalen Verdichtungen, die bis zu sechs Nucleosomen enthalten sollen. Für diese Anordnung, die alternativ zum Solenoid-Modell diskutiert wird, hat man den Begriff Superbeads geprägt. Wie auch immer die Struktur des 30-nm-Fadens im Detail aussieht, man rechnet auf dieser Stufe mit einem Verkürzungsgrad des DNA-Doppelstrangs von 40. Dieser Wert zur Verkürzung des DNA-Doppelstrangs beruht, wie auch die im Folgenden angegebenen Werte, auf Schätzungen, und die Angaben weichen in verschiedenen Publikationen voneinander ab.

1.6.3 Schleifendomänen (Tertiärstruktur)

Es spricht vieles dafür, dass eine weitere Verkürzung des DNA-Doppelstrangs erreicht wird, indem der 30-nm-Faden Schleifendomänen einnimmt. Werden Metaphasechromosomen ( Biochemie, Zellbiologie) durch Behandlung mit 2 M NaCl-Lösung von Histonen befreit, tritt eine faserige axiale Struktur zu Tage, die von einer Wolke aus DNA-Fäden umgeben ist (▶ Abb. 1.16). Die DNA-Fäden liegen in dieser Wolke als Schleifendomänen vor, deren Basen in der axialen Struktur verankert sind. Die Schleifendomänen sind unterschiedlich groß und bestehen aus 5 bis 200 kb DNA (Durchschnitt 63 kb). Sie können eine oder mehrere Transkriptionseinheiten enthalten. Dies sind Abschnitte der DNA, an denen genetische Information abgelesen (transkribiert) wird. Die faserige axiale Struktur wird als Proteingerüst (protein scaffold) bezeichnet und setzt sich aus Nicht- Histon-Proteinen zusammen. Es hat sich gezeigt, dass nur bestimmte DNA-Abschnitte mit dem Proteingerüst in Kontakt stehen. Für diese DNA-Abschnitte sind zwei Begriffe in Umlauf. Man nennt sie entweder Matrix-associated Regions (MARs