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- Herausgeber: Publicacions de la Universitat de València
- Kategorie: Wissenschaft und neue Technologien
- Serie: Educació. Sèrie Materials
- Sprache: Spanisch
Las técnicas de proceso y de análisis de la imagen digital resultan cada vez más imprescindibles para el estudio o el trabajo relacionado con la biología. Un libro fundamental, de carácter divulgativo, que permite incorporar al currículum de los estudiantes de Biología las materias necesarias para conocer las más recientes técnicas de análisis de la imagen digital.
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Seitenzahl: 434
Veröffentlichungsjahr: 2015
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TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE IMAGEN
Educació. Materials 65
TÉCNICAS DE ANÁLISIS DE IMAGEN
CONCEPTOS BÁSICOS
José F. Pertusa Grau
UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
Colección: Educació. Materials
Director de la colección: Guillermo Quintás Alonso
Esta publicación no puede ser reproducida, ni total ni parcialmente, ni registrada en, o transmitida por, un sistema de recuperación de información, en ninguna forma ni por ningún medio, ya sea fotomecánico, foto químico, electrónico, por fotocopia o por cualquier otro, sin el per miso previo de la editorial.
© El autor, 2010
© De esta edición: Universitat de València, 2010
1.ª edición: junio 2003
2.ª edición corregida: febrero 2010
Coordinación editorial: Maite Simón
Maquetación y composición de la cubierta: Celso Hernández de la Figuera Corrección: Francesc B. Salas
ISBN: 978-84-370-8288-2
Índice
INTRODUCCIÓN
Capítulo 1. La imagen
1.1 Análisis de imagen y procesado de imagen
1.2 Tipos de imagen con interés biológico
1.2.1 Ondas electromagnéticas transmitidas
1.2.2 Ondas electro-magnéticas reflejadas
1.2.3 Ondas electromagnéticas emitidas
1.3 La imagen real y nuestra percepción del mundo
1.3.1 Mecanismo de estereopar
1.3.2 Referencias espaciales
1.3.3 Movimiento
1.3.4 Juego de luces y sombras
1.4 Información contenida en la imagen
1.4.1 Información espacial
1.4.2 Información espectral: energía radiante
1.5 Objetos, fondos y campos
1.6 Los objetos en análisis de imagen
1.7 Morfometría y estereología
Capítulo 2. Algunos métodos manuales para la estimación de medidas
2.1 Qué medir y cómo
2.2 Estimación del área
2.2.1 Aproximaciones geométricas
2.2.2 Recuento de áreas unitarias
2.2.3 Método de la pesada
2.2.4 Estimación del área por el método de la rejilla de puntos
2.3 Estimación de la longitud
2.3.1 El método de Buffon
2.3.2 Cálculo del perímetro
2.4 Errores de medida
2.4.1 Unidades de medida y errores
2.4.2 Precisión del método en función del número de puntos de la rejilla
2.4.3 El error experimental
Capítulo 3. Análisis de imagen asistido por ordenador
3.1 Orígenes del análisis de imagen
3.2 Los primeros analizadores
3.3 La era de la digitalización
3.4 La expansión de la memoria y el tratamiento de grises
3.5 Lo analógico y lo digital
3.5.1 Sistemas de referencia
3.5.2 Analógico/Digital
3.5.3 El píxel
Capítulo 4. Arquitectura del sistema
4.1 ¿Qué es un ordenador digital?
4.2 Representación de la información
4.3 Programas y datos
4.4 La máquina virtual: el sistema operativo
4.5 La era de las ventanas
4.6 Una nueva ojeada a la arquitectura del sistema
4.7 Sistemas de captación de imagen
4.7.1 Tubos termoiónicos tradicionales
4.7.2 Cámaras de sensor de estado sólido o CCD (Charge-Coupled Device)
4.7.3 Cámaras digitales
4.8 Características técnicas de las cámaras de vídeo
4.8.1 Sensibilidad
4.8.2 Rango de sensibilidad
4.8.3 Gamma
4.8.4 Resolución
4.8.5 Respuesta espectral
Capítulo 5. La imagen digital
5.1 Digitalización de la imagen
5.2 Profundidad
5.3 Resolución
5.4 El histograma de nivel de gris
5.5 Escalado del nivel de gris y paletas de falso color
5.5.1 Escalado del nivel de gris
5.5.2 Paletas de color: falso color
5.6 Digitalización del color real
5.7 Cómo congelar, grabar y recuperar las imágenes
5.7.1 Formato de imagen
Capítulo 6. Procedimiento general de trabajo en análisis de imagen asistido por computadora
6.1 Captura de la imagen
6.2 Segmentación
6.3 Detección de los objetos
6.4 Medidas
6.5 Operaciones adicionales y utilidades
Capítulo 7. Medidas en análisis de imagen
7.1 Parámetros morfométricos de campo
7.1.1 Número de partículas
7.1.2 Área como parámetro de campo
7.1.3 Perímetro como parámetro de campo
7.2 Parámetros morfométricos de objeto
7.2.1 Coordenadas de un objeto: distribución de objetos
7.2.2 Centroides
7.2.3 Área de un objeto
7.2.4 Medida de los diámetros Feret (diámetros de calibrador)
7.2.5 Longitud y anchura de los objetos
7.2.6 Longitud y anchura de fibra
7.2.7 Perímetro y perímetro convexo
7.2.8 Orientación de los objetos
7.2.9 Número de agujeros
7.3 Parámetros morfológicos derivados
7.3.1 Factor de forma circular
7.3.2 Rugosidad
7.3.3 Factores que relacionan la longitud de los ejes
7.4 Parámetros densitométricos
7.4.1 Nivel de gris
7.4.2 Densidad óptica
Capítulo 8. Procesado de imagen. Operaciones punto a punto
8.1 Restauración y mejora de la imagen
8.2 Operaciones punto a punto
8.3 Modificación del histograma de gris
8.3.1 Normalización
8.3.2 Ecualización
8.3.3 Otras manipulaciones del histograma de gris
8.4 Operaciones aritméticas con una imagen
8.5 Operaciones aritméticas con varias imágenes
Capítulo 9. Procesado de imagen. Operaciones entre píxeles vecinos
9.1 Filtros matriciales
9.2 Filtros de suavizado
9.2.1 Filtro de la media
9.2.2 Filtros gaussianos
9.2.3 El filtro de la mediana
9.3 Filtros de enfatizado
9.4 Utilización de los filtros
Capítulo 10. Detección de márgenes
10.1 Tipos de bordes
10.2 Operadores laplacianos
10.3 Operadores direccionales
10.3.1 Operadores cardinales (norte, sur, este, oeste)
10.3.2 Otros operadores direccionales
10.4 Operadores cruzados
10.4.1 Bordes de cuatro píxeles
10.4.2 El operador cruzado de Roberts
10.5 Otros detectores de margen
Capítulo 11. Segmentación: la imagen binaria
11.1 Técnicas basadas en el marcado de bordes
11.1.1 Perfilado manual de contornos
11.1.2 Detección de bordes como procedimiento de segmentación
11.2 Segmentación por umbrales
11.2.1 Utilización de umbrales de nivel de gris
11.2.2 Herramientas para la selección de umbrales
11.3 Segmentación automática
11.4 Segmentación múltiple
11.5 Otras técnicas de segmentación
11.5.1 Crecimiento de regiones
11.5.2 División y unión de regiones
11.6 Segmentación de la imagen en color
11.6.1 Cuando el color no es relevante
11.6.2 Utilización del color para la segmentación
11.7 Resultado de la segmentación
11.7.1 Significado de la imagen binaria
11.7.2 Criterios de representación de la imagen binaria
Capítulo 12. Procesado de la imagen binaria
12.1 Morfología matemática
12.2 Conectividad
12.3 Erosión y dilatación
12.4 Apertura y cierre
12.5 Otras operaciones de morfología matemática
12.5.1 Rellenado de agujeros (hole fill)
12.5.2 Contorno
12.5.3 Esqueletización (Skeleton)
12.5.4 Elimina-bordes
12.5.5 Herramienta para separación de objetos. Distancia euclídea
12.6 Operaciones lógicas
12.6.1 El Álgebra de Boole
12.6.2 Operaciones booleanas
12.6.3 La función O-EXCLUSIVA
12.7 Operaciones booleanas con imágenes binarias
12.8 Máscaras binarias, reconstrucción de objetos y otras operaciones
12.8.1 Máscaras binarias
12.8.2 Reconstrucción de objetos
12.8.3 Operaciones de dilatación y erosión aplicadas a la imagen gris
12.9 Utilidad del procesado de la imagen binaria en análisis de imagen
12.9.1 Separación de objetos contiguos
12.9.2 Aplicación al aislamiento de objetos
12.9.3 Ejemplo de una secuencia normal de trabajo
Capítulo 13. Un poco de estereología
13.1 Principio de Delesse
13.2 Fracción de volumen (densidad de volumen)
13.3 La homogeneidad de la muestra: isotropía y anisotropía
13.4 Probabilidad geométrica
13.5 Los tests en estereología
13.6 Relación superficie/volumen (densidad de superficie) y relación perímetro/área (densidad de perímetro)
13.7 El volumen de los objetos
13.7.1 Objetos de geometría conocida
13.7.2 Objetos no regulares, de geometría compleja o desconocida
13.8 Recuento de objetos discretos (densidad numérica)
13.8.1 El método de De Hoff y Rhines
13.8.2 Generalización al método de De Hoff para partículas de forma constante
13.8.3 Método de Weibel y Gómez para partículas de forma constante
13.8.4 Corrección de Abercrombie
13.9 El efecto Holmes
13.10 El método del disector
13.11 Diámetro de partículas tridimensionales y en sección
13.12 Los parámetros estereológicos
Capítulo 14. Programas de análisis de imagen
14.1 Programas de libre distribución
14.1.1 Image J
14.1.2 Scion Image
14.1.3 Image Tool
14.1.4 Osiris
14.2 Programas comerciales
14.2.1 Image Processing Tool Kit
14.2.2 Visilog
14.2.3 Qwin (Leica)
14.2.4 Productos Media Cybernetics
14.3 Análisis de imagen en la red
BIBLIOGRAFÍA
ÍNDICE ANALÍTICO
APÉNDICE DE COLOR
Introducción
Las técnicas de proceso y análisis de la imagen digital se están apoderando de todos los campos de la biología; poco a poco se van sustituyendo las viejas cámaras fotográficas de los microscopios por las pequeñas y poderosas cámaras digitales; incluso en las nuevas técnicas microscópicas, la miscroscopía confocal, todo el manejo de las imágenes de los cortes ópticos se realiza por medio de un programa de procesado que la presenta en el monitor del ordenador.
Esta pequeña revolución digital está permitiendo que los laboratorios más modestos cuenten con muy eficaces sistemas de captura de imagen, lo que les permitirá acceder, a su vez, a las técnicas de análisis de imagen que antes estaban restringidas a los más pudientes.
Todo esto se ha traducido, desde el punto de vista docente, en la necesidad de incorporar al currículum de los estudiantes las materias que les permitan manejarse con soltura en las recién incorporadas técnicas de análisis de la imagen digital.
Pero la información bibliográfica disponible para los biólogos usuarios de estos nuevos métodos es, a mi criterio, reducida y limitada porque una parte de la información proviene de los manuales de los programas de ordenador que se instalan para el manejo de la imagen; el resto de la bibliografía se puede considerar altamente especializada y requiere que sus lectores tengan una sólida formación matemática.
Cuando comencé la composición de este libro me planteé como objetivo fundamental preparar un manual que acercase el análisis de imagen a aquellos profesionales y estudiantes universitarios que, siendo calificados como «de ciencias», se encuentran ciertamente tan alejados de la informática y la matemática como para sentirse incómodos frente al lenguaje puramente simbólico del álgebra y la lógica binaria.
Conforme avanzaba en la redacción comprendí que más que un objetivo se trataba de un reto. Resulta complejo introducir en el tema a personas que no han visto un programa de análisis de imagen o que, en el peor de los casos, aunque les interese conocer las posibilidades de la técnica aquí expuesta, el hecho de topar con la informática les puede disuadir de la lectura del manual. A esto hay que añadir que la excesiva simplificación del tema conlleva el riesgo de acabar produciendo un libro de divulgación que no alcanza el nivel de utilidad deseable.
No quiero afirmar que este manual haya conseguido los objetivos que me propuse y que resuelva el problema de la información, pero mi esfuerzo ha estado dirigido a paliar esa falta en mi entorno.
Conceptualmente este libro se presenta como una introducción a una de las técnicas morfométricas más recientemente incorporada a la biología, aunque el propio análisis de imagen ya lleve por el mundo unos cuantos años y se haya desarrollado ampliamente en campos como la meteorología o la astronomía.
Pese a que el soporte instrumental es un equipo informático, se ha intentado, en lo posible, no hacer exhaustiva descripción de su funcionamiento, sino cuando era estrictamente necesario. Por ello se podrá encontrar algún capítulo dedicado a estos artefactos con el que pensamos que, al menos, contribuiremos a incrementar la cultura de nuestros lectores en la lógica de funcionamiento de las máquinas de silicio.
Creo haber superado el escollo del rechazo inicial ordenando, juiciosamente, los razonamientos que nos llevan desde la necesidad de realizar un análisis, hasta el análisis mismo. En el desarrollo me he visto forzado, no obstante, a introducir conceptos matriciales, booleanos y geométricos que suenan peor de lo que en realidad son.
Pienso, con Stephen Hawking y su editor, que cada fórmula que aparezca en el libro supone una reducción del 10 % de los posibles lectores; así que debo de haber escrito el manual para mí mismo porque me he visto obligado, a pesar de todo, a mantener una docena de fórmulas, aunque que no sean más que productos o cocientes de parámetros como el área o el perímetro.
Con todo ello no quiero sino predisponer al lector a que profundice más en el tema tras su primer contacto a través de estas pocas páginas e, incluso, a pesar de ellas. Se trata de una poderosa herramienta para todos aquellos que se encuentren en los campos de la descriptiva y necesiten realizar medidas para caracterizar los elementos que estudian.
1. La imagen
El hombre, como el resto de los primates, es un animal eminentemente visual. Este hecho ha sido esencial en el desarrollo de nuestra especie, porque nos ha llevado a que nos valgamos de la imagen como elemento primordial para relacionarnos con nuestro entorno. La imagen es un pilar fundamental en las relaciones con nuestros semejantes, de manera que la mayor parte de la información del mundo la recibimos por medio del sentido de la vista.
Hasta tal punto somos animales visuales que hemos llenado el lenguaje coloquial de expresiones referidas al uso de este sentido. Desde el clásico aforismo que dice que «una imagen vale más que mil palabras», hasta giros como «no lo veo claro» u otros como «¿lo ves?» o «se le ve venir», son alusiones metafóricas a la relación que encontramos entre la comprensión de una situación y la percepción visual.
Y si la imagen es esencial en la vida cotidiana, no digamos cuánto lo es en la investigación científica. También la ciencia apoya su trabajo en las imágenes y es posible que la biología, en especial, sea una de las materias que genere mayor cantidad de imágenes. La observación minuciosa y el análisis de estas imágenes son la base de la actividad científica que permite obtener información para plantear hipótesis y comprobarlas.
¿Cómo nos enfrentamos a la información visual? Toda imagen que percibimos es analizada por el cerebro de manera automática. El análisis aporta gran cantidad de información porque el cerebro, trabajando de forma comparativa, permite reconocer y clasificar objetos de muy diversa complejidad; reconocemos letras en un texto, la marca y el modelo de un coche o los rostros de otros miembros de nuestra especie. Este análisis nos da idea del aspecto, forma, textura, distancia, velocidad relativa, tipo de movimiento y otras particularidades ligadas a los objetos contenidos en las imágenes. Esta capacidad humana es, hoy por hoy, inalcanzable para cualquier máquina, ordenador o sistema informático, por muy complejo que sea. Ninguna máquina tiene la capacidad del cerebro humano para clasificar objetos; ni siquiera muchos otros animales son capaces de competir con el sistema binario humano ojo-cerebro, ya que aquellos son incapaces de reconocer a sus propios congéneres.
La fantástica capacidad de clasificación de nuestro cerebro se basa, fundamentalmente, en la comparación de las imágenes. Nuestro análisis es cualitativo y casi inmediato. Si en una reunión de amigos alguien nos presenta a otra persona, inmediatamente sabemos, mirando únicamente su cara, si se trata de un hombre o una mujer; somos capaces de clasificar rápidamente el sexo de nuestros congéneres (muy pocas veces erramos) comparando el nuevo rostro con los rostros de nuestros conocidos, y extrayendo de inmediato el estereotipo «sexo al que pertenece». Los detalles comparativos en los que basamos nuestra clasificación son muy sutiles y vagos, pero lo suficientemente claros para proporcionarnos un altísimo índice de certeza, excepto en ciertas situaciones en las que el patrón se hace difícil de aplicar y se nos plantean serias dudas ante un rostro indefinido como el de un niño.
Ahora bien, el cerebro humano no es muy bueno cuando se trata de realizar un análisis cuantitativo de la imagen. Si se nos presenta un grupo de personas de pie, no tendremos demasiados problemas en ordenarlos por altura, pero tendremos ciertas dificultades para calcular la altura de uno en particular, incluso teniendo delante una referencia de longitud. Sin embargo este tipo de cuantificaciones es muy corriente en la tarea científica básica y es aquí donde los ordenadores pueden ser de mucha utilidad, en especial cuando se precisa automatizar una tarea de cuantificación para hacerla repetitiva. Y, simplemente, en eso consiste el análisis de imagen.
Ciertamente, un equipo de análisis de imagen puede identificar y clasificar objetos, pero el procedimiento que utiliza en esta operación es, precisamente, el opuesto al que utiliza nuestro cerebro: mientras que el cerebro clasifica sin medir, por comparación del problema actual con los datos acumulados con ante-rioridad, el equipo de análisis de imagen mide primero, obtiene datos numéricos de la morfología (área, perímetro, longitud, anchura) y las características ópticas (color, densidad óptica) y, en función de esos parámetros, clasifica los objetos.
1.1 Análisis de imagen y procesado de imagen
El término «análisis de imagen» hace referencia al estudio realizado sobre la imagen con el fin de obtener información de ella. En principio, no se trata de obtener específicamente datos cuantitativos o cualitativos. Pero, dado que para nosotros es más complicado apreciar las dimensiones de las cosas y que nos es más costoso medir un objeto que recordar su forma, el tiempo ha ido relacionando casi unívocamente el término «análisis de imagen» con la obtención de información cuantitativa.
Así pues, se podría definir nuevamente el término de análisis de imagen como un «proceso» mediante el cual se extrae información cuantitativa de la imagen. Por otra parte, esta definición no implica que el proceso deba realizarse de una manera especial; simplemente se extrae información cuantitativa de la imagen. La obtención manual de un dato a partir de una fotografía utilizando una regla o un pie de rey también es un análisis de imagen. Sin embargo, tal y como hoy en día es entendido, el análisis de imagen es un proceso llevado a cabo por un sistema informático, capaz de extraer de forma casi instantánea toda la información relevante contenida en una imagen determinada.
Deberíamos hacer una matización ahora que hemos introducido el ordenador digital como herramienta primordial en análisis de imagen porque se tiende a confundir el concepto de análisis de imagen con el de procesado de la imagen. La diferencia queda bien patente en la definición apuntada más arriba: un analizador de imagen siempre cuantifica y, por lo tanto, el resultado del análisis de imagen siempre es una tabla de datos, una gráfica o cualquier representación de los datos numéricos. El procesado de imágenes, sin embargo, siempre produce otra imagen como resultado de la operación; en este caso se pretende, por lo general, mejorar la calidad de una imagen para facilitar la observación de determinados detalles. Un sencillo ejemplo de procesado de imagen que solemos ver con cierta indiferencia es el de los mapas meteorológicos de temperaturas, en los que se colorean los mapas con diversos tonos cálidos (en la gama de los rojos) o fríos (en la de los azules) para facilitar la observación del espectador. Dentro del trabajo científico también se utiliza este sencillo sistema para destacar elementos de la imagen; así, es frecuente encontrar coloraciones con falso color en gamas cálidas o frías para destacar actividad cerebral o regionalización de estructuras en imágenes radiográficas; incluso se utiliza con éxito en la divulgación científica, para hacer más bonitas las imágenes obtenidas por el microscopio electrónico que, como todo el mundo sabe, se obtienen en el más absoluto blanco y negro. La razón de este maquillaje colorista se encuentra en que el ojo humano aprecia mucho mejor los contrastes cromáticos que las diferencias de tonos grises, tal y como lo atestigua la anatomía de la retina dotada de conos y bastones.
El procesado de imágenes puede ser útil, imprescindible en ocasiones, como un paso previo al análisis de la imagen. De hecho, mediante esta técnica se pueden destacar aquellos detalles de la imagen que se quieren medir, o eliminar aquellos otros que dificulten o enmascaren los elementos más esenciales. Es obvio que cualquier modificación de la imagen puede suponer la alteración de la información allí contenida y, por ello, cuando el procesado es un paso previo al análisis, debemos valorar si las modificaciones que se puedan producir en la imagen afectan a los parámetros de nuestro interés.
Un ejemplo biológico que puede resumir lo expuesto hasta el momento es el análisis cariotípico de un individuo cualquiera (fig. 1.1). El proceso comienza con la paralización de las células en la metafase de la mitosis, lo que normalmente se consigue con la adición de un veneno de los microtúbulos como la colchicina que impide que prosiga el reparto cromosómico. A continuación se deposita la célula sobre un portaobjetos, procurando que se rompa la membrana celular para que los cromosomas queden separados y extendidos sobre el portaobjetos. Se colorean los cromosomas y, por último, se obtiene una imagen, supongamos, fotográfica. Ahora ya tenemos posibilidad de analizar una imagen. Y ¿qué buscamos analizar? Pues el número y tamaño relativo de los cromosomas. Para ello los colocaremos ordenadamente en función de sus longitudes y de la posición relativa de su centrómero, y construiremos el idiograma.
Fig. 1.1 Cromosomas de ratón. Imagen en negativo (izq.) y positivo (der.).
El positivado en papel a partir del negativo fotográfico (que es, en realidad, la imagen captada más próxima a la original) ya es un procesado de imagen que consiste en la conversión de las partes negras de la imagen en blancas y viceversa. Este procesado tiene como único objetivo que tengamos una representación visual de los cromosomas lo más semejante posible a como los vemos a través del microscopio.
Si comenzamos nuestro análisis de imagen por el recuento de cromosomas, enseguida obtendremos el dato numérico. Es un análisis de imagen sencillo pero un análisis al fin y al cabo; incluso si algún cromosoma ha caído superpuesto a otro y sus brazos se cruzan, nuestra pericia técnica nos permite detectar que son dos elementos distintos y anotar dos marcas en vez de una. Pero si pretendemos ordenar los cromosomas por tamaño, deberemos medir sus longitudes y, conocidas sus longitudes, recortarlos y pegarlos en el orden correcto. Dejando por el momento el problema del cálculo de la longitud de un cromosoma, para separar dos de ellos que hayan caído cruzados en la muestra, deberemos hacer dos copias de la imagen para que podamos recortar en cada copia uno de los cromosomas. Una vez recortados los cromosomas se pegan en una lámina, ya ordenados y… ¡por fin!, ¡Idiograma conseguido! Pues bien, todas las manipulaciones y copias de la foto, los recortes y composición de los cromosomas, no son sino procesos sobre la imagen. El auténtico análisis, por ahora aplazado, es el cálculo de las dimensiones de los cromosomas, que es justamente lo que nos permite la correcta ordenación por tamaños.
No siempre se precisa del procesado de la imagen para realizar el análisis de imagen. El recuento de eritrocitos con una cámara cuentaglóbulos es uno de esos casos. La técnica preparatoria asegura que el recuento se pueda llevar a cabo con solo cargar la cámara de recuento; entonces el experimentador puede comprobar que unos discos refringentes, los eritrocitos, se encuentran esparcidos sobre una rejilla cuadriculada. El análisis acaba cuando obtenemos el número de eritrocitos contenidos en un número de cuadrículas determinado, esto es, en un área de referencia.
1.2 Tipos de imagen con interés biológico
Las imágenes biológicas se generan por interacción de las ondas electro-magnéticas con los objetos biológicos. En realidad todas las imágenes cotidianas del mundo que nos rodea se generan de forma semejante, aunque nuestra apreciación de lo cotidiano a veces no nos permite percatarnos de manera consciente del mecanismo por el que un objeto se hace visible a nuestros ojos. Pero como el presente manual va dirigido especialmente a los estudiantes del área de biología, nos vamos a centrar en las imágenes que con mayor frecuencia se manejan en esta disciplina.
1.2.1 Ondas electromagnéticas transmitidas
Se trata del sistema que utiliza la microscopía de transmisión. Una fuente de ondas electromagnéticas, que suele ser una bombilla en el caso de la microscopía óptica y un filamento incandescente en la microscopía electrónica (aunque en este caso la luz es un haz de electrones), genera un rayo que atraviesa la muestra biológica que se encuentra interpuesta en su camino. En la interacción de la luz con el espécimen se produce la absorción, reflexión y refracción de la luz al atravesar las distintas estructuras que componen el material biológico, con lo que la luz se desvía de su recorrido y se produce una imagen con regiones de luces y sombras.
El fenómeno de interferencia se puede incrementar con la adición de colorantes o contrastantes, según sea el caso, con distinta afinidad por los elementos de la muestra; entonces se produce la absorción de determinadas bandas del espectro de luz y de esa manera se pueden observar, en microscopía óptica, partes con diversas coloraciones que hacen más evidentes y más contrastadas las diferentes porciones de la muestra. La aplicación de contrastantes en micros-copía electrónica de transmisión hace que algunos elementos de la muestra se mantengan permeables a los electrones, mientras que otros se hagan opacos a los mismos, con lo que se produce igualmente el incremento de contraste entre los orgánulos celulares. La imagen que se genera está compuesta por zonas más o menos claras, según la concentración de los colorantes o la presencia de sustancias opacas a los electrones. Nótese que las imágenes de microscopía óptica están dotadas de color, mientras que las procedentes de microscopía electrónica son imágenes monoespectrales.
En todos los casos la característica común es que la dirección del haz de luz y la posición de la muestra forman un ángulo de 90 grados. Los fenómenos de reflexión no intervienen de manera importante en la formación de este tipo de imágenes, con excepción de ciertos casos, por lo que la imagen rara vez nos produce sensación de profundidad: se trata de imágenes, literalmente, planas.
Fig. 1.2 Epitelio de la cara inferior de la lengua del ratón. Micros-copía óptica de luz transmitida.
Fig. 1.3 Células hematopoyéticas de la dorada (Sparus aurata). Microscopía electrónica de transmisión. (Imagen cedida por el Dr. J. Meseguer. Departamento de Biología Celular. Universidad de Murcia).
1.2.2. Ondas electromagnéticas reflejadas
Este es el mecanismo que todos conocemos en la generación común de las imágenes que percibimos en la vida cotidiana. La luz procedente de una o diversas fuentes incide sobre los objetos y se refleja en ellos con un ángulo que depende del propio ángulo de incidencia del haz de radiación y de la geometría de la superficie del objeto. Además de las propias características de los objetos que hacen que se absorba una determinada cantidad de luz de un espectro determinado, la disposición relativa de la fuente de luz y la muestra hace que se obtengan sombras que le dan a la imagen sensación de profundidad.
Aparatos como los microscopios estereoscópicos, las lupas, nos proporcionan imágenes de este tipo. El microscopio de barrido genera imágenes parecidas a las descritas, aunque en realidad la imagen se produce por otro mecanismo más parecido al que trataremos a continuación, la emisión de ondas electromagnéticas. A pesar de todo, la imagen producida por este tipo de microscopio electrónico nos produce la sensación de que se trata de imágenes obtenidas por luz reflejada, porque la posición de las sombras simula esos dibujos artísticos al carboncillo en los que la profundidad la obtenemos por los bordes difusos del sombreado.
Fig. 1.4 Imagen de un embrión de pollo obtenida con un microscopio estereoscópico.
Fig. 1.5 Alga del fitoplancton (Emiliania huxleyi). Microscopía electrónica de barrido. (Imagen cedida por el Dr. J. Alcober. Departamento de Botánica. Universitat de València).
1.2.3 Ondas electromagnéticas emitidas
El tercer tipo de imagen es aquel que se produce cuando el propio objeto es el que emite la luz (o los electrones). Son muy raros los casos en los que un objeto emite luz por si mismo, sin estimulación previa del experimentador, pero incluyen un fenómeno de interés biológico como es la bioluminiscencia. Con una cámara suficientemente sensible se puede obtener una imagen de una luciérnaga, por ejemplo, o de la traza que deja durante su vuelo.
Pero el mecanismo más común que produce imágenes biológicas de este tipo es el fenómeno conocido como fluorescencia. Determinadas sustancias son capaces de absorber fotones muy energéticos al ser iluminadas con una luz de una longitud de onda específica (luz incidente) y liberar parte de esa energía absorbida como fotones de menor energía. La forma más frecuentemente utilizada es la aplicación de fuentes de luz azul, violeta o ultravioleta, que producen la emisión de luz roja, amarilla, verde o azul por las muestras biológicas.
Podemos encontrar muy diversos instrumentos biológicos que utilizan el principio de la fluorescencia para analizar las muestras; destacamos el propio microscopio de epifluorescencia, con el que se observan muestras microscópicas tratadas previamente con colorantes fluorescentes específicos o con trazadores marcados con estos colorantes. Los lectores de electroforesis para ácidos nucleicos utilizan como principio la afinidad específica de los nucleótidos por sustancias fluorescentes, como el bromuro de etidio, para iluminarlas posteriormente con luz ultravioleta y determinar las acumulaciones de estas moléculas en bandas según su peso molecular y la carga eléctrica.
Fig. 1.6 Bandas electroforéticas de ADN en un gel de agarosa. Fluorescencia de bromuro de etidio.
La microscopía electrónica de barrido se fundamenta en un fenómeno semejante. En este caso las muestras se iluminan con un haz de electrones muy energéticos que barre su superficie; esto produce la emisión de electrones menos energéticos (los llamados electrones secundarios) que son detectados por una sonda y utilizados para generar una imagen de vídeo que se ofrece en una pantalla convencional. Como se ve, el mecanismo implica la emisión de radiación, a pesar de que la interpretación de la imagen la hagamos como procedente de una lupa por su juego de luces y sombras.
1.3 La imagen real y nuestra percepción del mundo
El mundo real es tridimensional. Nuestra percepción del mundo nos da la falsa sensación de que las imágenes también lo son, a pesar de que las imágenes son intrínsecamente bidimensionales. De hecho se trata de haces de luz proyectados sobre un plano. ¿No se trata de una paradoja? La respuesta es no.
La apariencia tridimensional de las imágenes que nosotros percibimos se debe a un procesamiento de la información visual llevada a cabo por nuestro cerebro, por medio de cuatro mecanismos básicos: las referencias espaciales, el movimiento, el mecanismo de estereopar y el juego de luces y sombras.
1.3.1 Mecanismo de estereopar
La retina de cada uno de los ojos, que es una estructura bidimensional, detecta una imagen diferente del campo visual. El cerebro tiene la capacidad de sumar estas dos imágenes bidimensionales y obtener, a partir de sus diferencias, una tercera dimensión sin necesidad de ninguna otra referencia.
1.3.2 Referencias espaciales
Utilizamos las líneas de fuga que determinan la perspectiva de la imagen para estimar la distancia relativa de los objetos al observador. Siempre que miramos al horizonte vemos cómo las líneas paralelas de los objetos de nuestro campo visual se hacen confluentes en algún lugar del horizonte. Además, el tamaño relativo de los objetos conocidos nos permiten interpretar a qué distancia, también relativa, se encuentran situados. Todos tenemos una idea de la estatura normal de una persona; por esa razón, podemos interpretar que dos figuras humanas se encuentran a distintas distancias cuando una de ellas es notablemente menor que la otra y no se trata de niños o individuos sentados. Incluso interpretamos como más próximos aquellos objetos que se ven enteros y más lejanos, los que se encuentran medio ocultos por otros enteros que se sitúan delante.
1.3.3 Movimiento
En una imagen dinámica, el movimiento relativo percibido por el observador también da idea de distancia, ya que el movimiento de los objetos se percibe con una velocidad inversamente proporcional a la distancia a la que están situados: más rápidos los próximos y más lentos los lejanos. Una persona que se desplaza en un vehículo puede apreciar cómo las montañas del horizonte permanecen relativamente estáticas, mientras que las casas y los árboles desaparecen de su vista tanto más rápido cuanto más cerca se encuentran de la carretera.
1.3.4 Juego de luces y sombras
La luz emitida por una fuente luminosa puntual produce, al incidir sobre los objetos, una imagen con zonas en sombras y zonas bien iluminadas distribuidas según el relieve de los mismos. El cerebro aprovecha esta característica para extraer información sobre la dimensión y la profundidad de la imagen. Es notable que muchos sistemas de observación biológica utilizan mecanismos especiales para la creación de sombras con las que dar la sensación de relieve a las muestras, la microscopía electrónica de barrido, la microscopía de contraste interferencial o la criofractura, por ejemplo.
No obstante, no siempre percibimos en biología la tercera dimensión de las imágenes, ya que los aparatos de observación biológica más corrientes, los microscopios de transmisión (ópticos o electrónicos), producen imágenes planas. La tercera dimensión debida al grosor de las muestras queda anulada al obtenerse imágenes como proyecciones sobre el plano focal. En estos casos nuestro sistema visual no es capaz de interpretar la imagen sino como plana.
Así pues, y como conclusión, las imágenes son siempre bidimensionales, aunque el cerebro puede utilizar mecanismos que le informan de la tercera dimensión del mundo real y que le permite interpretar la imagen como tridimensional.
Esta propiedad, lejos de ser inconveniente, nos facilita en gran medida el objetivo del análisis de imagen ya que, anulada una de las dimensiones, siempre trabajaremos en el plano bidimensional. Cuando se precise el volumen como tercera dimensión, se deberá hacer intervenir el espesor del corte en aquellas imá-genes que sean proyecciones planas consecutivas, como los cortes histológicos.
1.4 Información contenida en la imagen
Pero ¿qué información se puede extraer de una imagen? Fundamentalmente hay dos tipos de información contenida en la imagen susceptible de ser extraída mediante técnicas de análisis de imagen cuantitativo: información espacial e información espectral.
1.4.1 Información espacial
Cuando nos referimos a información espacial debemos pensar en todos aquellos parámetros que se presentan en un espacio bi o tridimensional. Podemos pensar inmediatamente en las medidas de los objetos como parte de sus características dimensionales, bien sea el área, el perímetro, el volumen o sus longitudes.
Pero también podemos referirnos con el término «información espacial» al patrón de distribución de los objetos en el plano, a la posición de estos objetos en un sistema de referencia como las coordenadas cartesianas. En este caso podemos considerar como parámetros de interés la distancia entre objetos y, de aquí, otros como la agrupación o dispersión de los objetos en la imagen.
Fig. 1.7 Neuronas amacrinas dopaminérgicas de una retina de lagarto extendida sobre la superficie de un portaobjetos. Las células parecen mostrar un patrón de distribución en el plano de la retina, mostrando una distancia media entre ellas casi constante. (Imagen cedida por los Drs. F. Martínez y E. Lanuza. Departamento de Biología Funcional y Antropología Física. Universitat de València).
La información espacial proporciona datos morfométricos, datos que son la expresión numérica de la forma, tamaño, número y distribución de los objetos en la imagen.
1.4.2 Información espectral: energía radiante
Como ya se ha insistido con anterioridad, las imágenes se obtienen al interaccionar la energía electromagnética con los objetos. Salvo en el caso de que la iluminación se realice utilizando una fuente monocromática, las imágenes son multiespectrales, es decir, reflejan una mezcla de luz de diferentes longitudes de onda, de diferentes colores. Esta diversidad puede ser utilizada para obtener información cuantitativa relevante para la investigación biológica y, de hecho, muchos sistemas de análisis de imagen pueden abordar este aspecto procesando separadamente los tres colores básicos, rojo azul y verde, en los que se pueden descomponer el espectro visible. Trabajar con lo que se llama color real supone incrementar los requerimientos de los sistemas de análisis de imagen, lo que encarece el equipamiento y complica el procesado global.
En muchos casos no se necesita trabajar con una imagen de color real. Aunque volveremos sobre este asunto más adelante, queremos indicar aquí que el ojo humano detecta un objeto cuando se destaca del fondo que lo rodea; esta diferencia entre objeto y fondo se encuentra en la homogeneidad o heterogeneidad de la luz en las diferentes partes de la imagen: un área en la que aparezcan regiones con gran contraste de luces y sombras es interpretada como compuesta de objetos y fondo, mientras que un área con un nivel de iluminación homogéneo se interpreta como fondo.
Las diferencias de color también se pueden utilizar para diferenciar objetos y fondo; en este caso la homo-geneidad del color del fondo contrasta con el color de los objetos, con gamas o tonos de color distintos (fig. 1.8). Pero estas diferencias de color pueden resolverse fácilmente como diferencias de intensidad de luz utilizando filtros monocromadores. Por este motivo es corriente trabajar con imágenes monocromáticas obtenidas a partir de imágenes multiespectrales. La pérdida de información espacial es mínima y queda compensada por la simplificación del trabajo posterior y el abaratamiento de los costes.
Podemos representar la información contenida en la imagen en una gráfica tridimensional (fig. 1.9) en la que dos de las dimensiones corresponden a la situación espacial de la imagen y la tercera dimensión corresponde a la energía (como intensidad de luz) de cada punto de la imagen; la imagen se resuelve así en una función tridimensional que podría representarse como una superficie curva.
Las características espectrales de los objetos también pueden ser cuantificadas por medio del análisis de imagen. Algunos programas que permiten trabajar con imágenes con color real, permiten determinar el matiz, la intensidad y la saturación de color de los objetos de la imagen. Pero la aplicación más extendida del análisis de imagen, en lo que se refiere a la cuantificación de la luminosidad de los objetos, es la obtención de los llamados parámetros densitométricos; con ellos se puede cuantificar la cantidad relativa de luz que atraviesa o refleja el objeto, tomando como referencia una región de la imagen con intensidad de luz conocida, o refiriendo la cantidad de luz del objeto a un patrón previamente establecido. En un capítulo posterior abordaremos la utilidad de estos parámetros y la forma de obtenerlos.
Fig. 1.8 Hoja de Arabidopsis thaliana sometida a tratamiento con ozono (100 ppm). La lesión en la hoja se puede apreciar como una mancha más clara en la parte superior-izquierda. (Imagen cedida por el Dr. P. Carrasco. Departamento de Bioquímica. Universitat de València).
Fig. 1.9 Representación de un densitograma tridimensional correspondiente a la banda marcada con el cuadrado.
1.5 Objetos, fondos y campos
Nuestra experiencia de observadores biológicos nos permite reconocer inmediatamente qué parte de la imagen es relevante para nosotros. De manera intuitiva llamamos objetos a los elementos de la imagen, distinguibles e independientes entre sí, que destacan sobre el fondo que los engloba.
En realidad somos capaces de reconocer un conjunto de estructuras y elementos que tienen una naturaleza común (color, forma, textura). Para facilitar la terminología, se suele utilizar el término «fase» para nombrar aquellas partes de la imagen que tiene una misma característica. Así, en biología se utiliza el término fase para referirse, en las células por ejemplo, al conjunto de elementos de igual naturaleza: se habla de la fase mitocondrial al referirnos al conjunto de mitocondrias de una célula. En términos generales, podemos decir que una imagen compuesta por un fondo en el que destacan unos objetos presenta dos fases; y que una imagen microscópica de una roca como la que se muestra en la figura siguiente tiene cuatro fases (una por tipo de mineral).
Fig. 1.10 Muestra de gabro adelgazada hasta formar una lámina fina. (Imagen cedida por el Dr. F. Robles. Departamento de Geología. Universitat de València).
Podemos concluir que una imagen biológica está compuesta de, al menos, dos fases, en donde una corresponde al fondo y la otra a los objetos. De lo contrario, una imagen con una sola fase no puede contener más que un fondo o tratarse de una región de un objeto.
Parece evidente, por lo tanto, que percibimos la información contenida en la imagen por el contraste visual entre sus fases. Esto es, las estructuras llaman nuestra atención porque presenta diferencias de color, de intensidad o de tono respecto al fondo. Tomemos como ejemplo esta misma página del libro para ilustrar lo que estamos diciendo: los objetos, en este caso las letras, destacan sobre el fondo blanco del papel. Se trata de un convenio basado en la relevancia implícita de las cosas. ¿Por qué consideramos las letras oscuras como los objetos? Porque, evidentemente, aquí son los elementos que contienen la información. De todas maneras no es concebible un objeto sin un fondo, de forma que ambos alternan en la imagen y son complementarios.
Pero debemos reconocer que las imágenes no siempre son tan sencillas como las compuestas por fondo y objeto. Algunas imágenes pueden mostrar cierta dificultad a la hora de definir qué es fondo y qué objeto. Una imagen microscópica tomada a gran aumento, por ejemplo, o la muestra de la roca que antes mencionábamos (fig. 1.10) constituyen dos casos en los que todos y cada uno de los elementos de la imagen pueden ser relevantes para el investigador. Pero en estos casos se puede aplicar también el principio de que los distintos elementos son distinguibles entre sí por las diferencias de color, intensidad o tono de cada uno de ellos.
Es evidente que el tratamiento de las imágenes para la obtención de datos no será el mismo según se trate de la página con texto o de la roca. Mientras que en una imagen compuesta por dos fases la información esencial puede ser el número total de objetos o el tamaño de cada uno de ellos, en la otra la información relevante puede ser el espacio relativo que ocupa cada uno de los componentes.
1.6 Los objetos en análisis de imagen
A pesar de que parece obvia la definición de objeto, desde un punto de vista académico la cosa no es tan sencilla. Muchos autores rechazan la utilización del término «objeto» tal y como hasta ahora hemos venido hablando de él, porque lo consideran inadecuado.
El rechazo se debe a dos razones: por un lado, cada objeto es identificado como tal, en análisis de imagen computerizado, cuando se somete la imagen a una operación denominada segmentación, detección o delimitación. Por medio de esta operación se elimina el fondo y se mantienen los objetos; entonces se presenta la imagen de una nueva forma, como una imagen binaria, porque todo el conjunto de matices de luz y color se ha restringido a zonas blancas sobre un fondo negro, o viceversa (exactamente como las letras en el papel). Esto significa que entenderemos como objetos a un conjunto de puntos iluminados (u oscuros) agrupados, conectados, aislados unos de otros por otros puntos negros (o blancos). Todo el proceso reduce la información a islas de elementos en un mar de fondo y, por lo tanto, a una imagen plana.
Por otra parte, estas islas de información blancas o negras que resultan del proceso de segmentación pueden no ser, en verdad, objetos reales independientes, sino partes todos del mismo objeto real. Algo así ocurre cuando se obtienen rebanadas de elementos tridimensionales, las secciones histológicas por ejemplo, en las que la forma tortuosa de los objetos reales contenidos en el volumen de tejido pueden presentarse en los cortes como elementos separados unos de otros. Una sección transversal de una mano a la altura de los dedos puede ilustrar esta situación: cada uno de los dedos se presentaría como independiente en un deter-minado plano de corte, siendo que todos se unen más tarde o más pronto en un miembro único.
Fig. 1.11 Imagen ideal resultante de realizar un corte de una mano humana a la altura de los dedos.
Así pues, muchos autores prefieren utilizar el término inglés features (características) para denominar lo que nosotros hemos llamado «objetos» (las rebanadas de los dedos), y reservan la palabra «objeto» para cuando se hable de una estructura tridimensional (la mano completa). En algunos casos ambos conceptos pueden coincidir, como ocurre en las imágenes de geles sometidos a electroforesis o las imágenes procedentes de lupas o macrofotografía. Por el contrario, pocas veces una sección histológica manifestará objetos reales sino features.
Para nuestro propio gobierno, y sin ánimo de contravenir ninguna norma internacional de análisis de imagen, proponemos denominar objeto a cualquier elemento de interés que sea destacable del fondo de la imagen y que deba ser sometido a análisis. Solamente tendremos presente, en cualquier caso, cuál es el origen de la imagen. No nos referiremos al objeto real, sino a ese grupo de puntos conectados, con contigüidad topológica, que tienen características semejantes.
La forma de caracterizar un objeto contenido en una imagen es, desde el punto de vista del análisis de imagen, por medio de sus propiedades numéricas, es decir, por medio de los parámetros que definen al objeto. Cuando se trate de superficies planas, de proyecciones o secciones de muy poco espesor, podremos recurrir directamente a la morfometría para caracterizar numéricamente los objetos. Cuando queramos obtener información tridimensional de los objetos reales a partir de las secciones o las proyecciones planas, recurriremos a la estereología.
1.7 Morfometría y estereología
Denominamos morfometría al conjunto de técnicas que nos permiten obtener las características dimensionales de los objetos. Utilizamos estas técnicas para determinar los valores de los parámetros que definen los objetos, como son el área, el perímetro, la longitud o la anchura.
Ya dijimos que el procedimiento general de medida comienza en las secciones histológicas, los esquemas o las proyecciones de las imágenes, por lo que nos encontramos en un mundo de dos dimensiones. La tercera dimensión y las relaciones dimensionales en el volumen de una muestra requieren un tratamiento especial, impuesto, principalmente, por la naturaleza propia de las muestras biológicas. Explicaremos con un sencillo ejemplo esta particularidad.
Supongamos que queremos estimar el diámetro nuclear de los hepatocitos. Como es corriente, hemos preparado cortes histológicos de hígados previamente fijados e incluidos en parafina o resinas sintéticas. Con el fin de que se puedan observar los detalles de las células, procuramos que los cortes sean suficientemente delgados, de unas pocas micras de grosor. Una vez contrastados los núcleos con los colorantes habituales, tomamos las imágenes para medirlas. Como los núcleos de los hepatocitos son prácticamente esféricos, un corte en cualquier sentido siempre nos proporciona una sección circular; pero es casi seguro que encontraremos núcleos de muy diversos tamaños, como cabría esperar si cortamos una esfera por un plano al azar: unas veces el plano pasaría cerca del polo y otras cerca del ecuador. Entonces, ¿cómo sabemos el diámetro real del núcleo?
Si hacemos varios cortes en serie, podemos llegar a cortar un núcleo completo desde un polo al otro. Localizando un núcleo en concreto y siguiendo su silueta en cada uno de los cortes, podremos estimar su diámetro aproximado de dos maneras:
Ambos procedimientos son laboriosos y no se encuentran exentos de incertidumbre. Si ahora queremos aplicar el método a una población de células con dos tipos de núcleos de distintos tamaños, el problema se complica hasta un límite insospechado. La determinación del diámetro mayor del núcleo en cada corte nos resuelve el tamaño del núcleo más grande, pero el núcleo de menor tamaño no lo localizaremos con exactitud, porque su diámetro mayor se confundirá con los de los cortes no centrales del núcleo más grande. Con la ayuda de la estereología y una cierta habilidad matemática podríamos acercarnos mucho más a la estimación del diámetro real del núcleo del hepatocito.
Como se ve, la estimación del diámetro de cada sección del núcleo es una tarea morfométrica, pero para la estimación del diámetro real de un objeto tridimensional necesitamos tener en cuenta algunas otras reglas que nos proporciona la estereología. Podemos definir la estereología como un cuerpo de métodos matemáticos que relacionan parámetros tridimensionales, que definen la estructura, con medidas bidimensionales obtenidas de las secciones de las estructuras.
2. Algunos métodos manuales para la estimación de medidas
2.1 Qué medir y cómo
Hemos expuesto en el capítulo precedente las bondades del cerebro humano en el reconocimiento de las más sutiles características de las imágenes y su «incapacidad» para apreciar las dimensiones de las cosas. Y sin embargo, tanto en biología como en otras ramas de la ciencia, la magnitud de las cosas es la cualidad más relevante para el investigador, porque por medio de la comparación de estas magnitudes es como puede percibir y cuantificar las diferencias o las semejanzas entre los elementos que está estudiando.
Así, por ejemplo, la relación entre la dosis y su efecto suele detectarse por la variación de la magnitud de un parámetro sensible al tratamiento, como el número de elementos o el tamaño de los mismos; o por ejemplo, la influencia de unas determinadas condiciones experimentales sobre los seres vivos; o la pauta de crecimiento y diferenciación de una estructura anatómica. En todos los casos la clave se encuentra en las diferencias de magnitud entre el grupo control y los distintos grupos experimentales, o entre una y otra población experimental. Pero, ¿qué queremos decir con diferencias de magnitud? ¿De qué magnitudes estamos hablando?
Las dos magnitudes más frecuentemente buscadas en biología son el número de elementos presentes y el tamaño de los mismos. Si bien el recuento de elementos no presenta muchas dificultades, la determinación del tamaño de un elemento puede ser una tarea ciertamente complicada. Dependiendo de la forma que adopte el objeto de nuestro interés, el tamaño puede venir determinado por la longitud, como en los ofidios, el área, como en la amplitud de los territorios de caza, el volumen, como en la capacidad de almacenamiento de glucógeno del hígado, el perímetro, y un largo etcétera de otros muchos parámetros de muy diversa utilidad.
En cada caso debemos enfrentarnos a la imagen con herramientas distintas para estimar cada una de las magnitudes que apuntábamos. Podemos obtener una longitud con cierta exactitud utilizando una regla, pero el cálculo del área es una tarea un poco más compleja. Y no digamos si queremos obtener un volumen de algo tan pequeño como una célula; la tarea se nos puede antojar casi imposible.
Los primeros métodos de medida que vamos a describir podíamos denominarlos métodos manuales, porque para abordarlos no nos apoyaremos más que en la imagen y en algunos principios de la geometría. Con ellos pretendemos dotar de una herramienta lógica y sencilla al lector, rescatándolo momentáneamente de la tiranía informática.
Por otra parte, el estudio de estos métodos tiene el interés adicional de que constituyen el nexo natural con la estereología y que su estudio nos permitirá reflexionar sobre problemas geométricos y espaciales que, en ocasiones, parecen estar abandonados en las técnicas ordinarias de análisis de imagen asistido por computadora. Decimos que este conjunto de métodos de medida se encuentra muy próximo a la estereología porque se implementaron lejos de la tecnología digital del análisis de imagen, con una gran base geométrica, un claro objetivo cuantitativo y, justamente, para poder inferir información tridimensional a partir de cortes histológicos. Por estos motivos algunos colegas los consideran los auténticos métodos biológicos de medida. Nosotros no queremos ser tan taxativos porque somos conscientes de que los métodos computerizados aportan tantas y tan buenas soluciones, que sería un tanto irreflexivo negar sus ventajas. De todas maneras, los métodos que estudiaremos a continuación pueden sacarnos de algún que otro apuro cuando, por ejemplo, nuestro ordenador se niegue a seguir nuestras instrucciones.
2.2 Estimación del área
2.2.1 Aproximaciones geométricas
El cálculo del área de un objeto puede ser algo muy sencillo cuando el objeto se aproxima a una figura geométrica regular. La geometría nos facilita el cálculo de superficies de objetos regulares, circulares o rectangulares por ejemplo, a partir de su radio o de la longitud de sus lados. Pero este no suele ser el caso más frecuente y la aproximación a una figura de geometría regular no está exenta de cierta imprecisión, dependiendo de la forma del objeto y la capacidad de apreciación del observador.
Con un sencillo ejemplo podemos ilustrar cuándo sería aplicable el método basado en la aproximación a una figura geométrica regular. Supongamos que queremos averiguar el volumen de sangre que circula por un segmento de la arteria aorta de un centímetro de longitud; para ello disponemos de dos cortes transver-sales de sendas aortas fijadas en contracción y relajación (en sístole y diástole cardiaca), porque la presión sanguínea hace que se deforme la pared elástica de la arteria y es evidente que los momentos cumbres de máximo y mínimo contenido corresponderán a los volúmenes arteriales en ambas circunstancias1. La imagen real se parece mucho al esquema presentado en la fig. 2.1.
Fig. 2.1 Idealización de la sección transversal de una arteria en estado de máxima dilatación (izquierda) y en relajación (derecha).
Nótese que la sección de la arteria se puede aproximar, en ambos casos, a un círculo, aunque más perfecto en la etapa de sístole que en la de diástole; la irregularidad apreciable en la diástole se debe a que, en este periodo, se produce un contorno festoneado en la arteria como consecuencia de la relajación de las fibras elásticas que forman la pared. Aun así podemos considerar que la luz de la arteria en ambos momentos se puede aproximar a un círculo, por lo que podremos estimar directamente en el microscopio, mediante un micrómetro ocular, o sobre imágenes fotográficas de las preparaciones, utilizando una sencilla regla, el diámetro interior de las aortas y aplicar la fórmula del área del círculo (A=πr2
