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- Herausgeber: Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA
- Kategorie: Fachliteratur
- Sprache: Deutsch
In seinem Buch zur pharmazeutischen Mikrobiologie geht Michael Rieth, promovierter Mikrobiologe mit langjähriger Erfahrung in mikrobiologischer Qualitätsprüfung in der pharmazeutischen Industrie, auf alle Aspekte dieses für die Pharmaproduktion unentbehrlichen Gebietes ein. Schwerpunkte sind Methoden der Qualitätskontrolle, das Umgebungsmonitoring in der Pharma- und Chemieproduktion sowie die Betriebshygiene. Der Fokus liegt auf bakteriologischen Verfahren einschließlich der mikrobiologischen Schnellmethoden; daneben werden aber auch Zellkulturmethoden und Tiermodelle behandelt. Für die zweite Auflage wurden unter anderem die Themen "Low Endotoxin Recovery" und Maskierung / Demaskierung von Endotoxinen neu aufgenommen. Wo immer möglich, werden die Bezüge zu den neuesten Ausgaben der europäischen und US-amerikanischen Arzneibücher hergestellt.
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Seitenzahl: 580
Veröffentlichungsjahr: 2017
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Inhaltsverzeichnis
Cover
Titel
Impressum
Widmung
Vorwort zur zweiten Auflage
Vorwort zur ersten Auflage
Abkürzungen
1 Einführung in die Mikrobiologie
1.1 Historisches
1.2 Bedeutung
1.3 Mikroorganismengruppen
1.4 Die Bakterienzelle
1.5 Taxonomie der Mikroorganismen
1.6 Medizinische Mikrobiologie
2 Rahmenbedingungen für den Betrieb mikrobiologischer Laboratorien
2.1 Gesetze und technische Regelwerke
2.2 Medizinische Betreuung der Mitarbeiter
2.3 Betriebsbeschreibung für mikrobiologische Laboratorien
2.4 Einrichtung mikrobiologischer Laboratorien
2.5 Nährmedien
2.6 Rezepturen
3 Kalibrierung und Qualifizierung der Geräte
3.1 Waage
3.2 pH-Meter
3.3 Kolbenhubpipetten
3.4 Stoppuhr
3.5 Geräte zur Erreichung bestimmter Temperaturen
3.6 Clean Bench
3.7 Air Sampler
3.8 Partikelzähler
3.9 Messgerät zur Bestimmung der Wasseraktivität
3.10 Fotometer/Reader
3.11 Tube Reader für Endotoxinbestimmungen
3.12 Fluoreszenzreader für Endotoxinbestimmungen
4 Stammhaltung
4.1 Bezug
4.2 Versand
4.3 Lagerung
4.4 Kultivierung
5 Betriebshygiene
5.1 Hygiene
5.2 Mikrobiologische Grundlagen zur Hygiene
5.3 Hygienemaßnahmen
5.4 Sterilisation, Desinfektion und aseptische Herstellung
5.5 Hygieneplan für mikrobiologische Laboratorien
5.6 Schädlingsbekämpfung (
Pest Control
)
5.7 Hygienebeauftragte
5.8 Durchführung von Hygieneschulungen
6 Umgebungsmonitoring
6.1 Methoden
6.2 Mikrobiologisches Monitoring im Sterilitätstest-Isolator
6.3 Physikalisches Monitoring in der Sterilproduktion
6.4 Physikalischer Betrieb
6.5 Auswertung der Mikroorganismen
6.6 Register der Mikroorganismen
7 Qualitätskontrolle
7.1 Arzneibuchmethoden (
Compendial Methods
)
7.2 Nichtarzneibuchmethoden (
Non-compendial Methods
)
7.3 Tests unter Verwendung von Tiermodellen
7.4 Zellkulturmethoden
7.5 Validierung der Arzneibuchmethoden
8 Prozessvalidierungen
8.1 Nährmedienabfüllung (
Media Fill
)
8.2 Entpyrogenisierung
8.3 Validierung der Sterilisation mit trockener Hitze
8.4 Validierung der Sterilisation mittels feuchter Hitze (Autoklav)
8.5 Validierung der Sterilfiltration
8.6 Container-Closure-Integrity-Test
8.7 Reinigungsvalidierung
9 Mikrobiologische Untersuchung von Wasser
9.1 Probennahme
9.2 Probentransport
9.3 Verwendung der verschiedenen Wasserqualitäten
9.4 Gereinigtes Wasser (Aqua purificata, AP)
9.5 Hochgereinigtes Wasser (HPW)
9.6 Wasser für Injektionszwecke (WfI)
9.7 Wasser zum Verdünnen konzentrierter Hämodialyselösungen
9.8 Wasser zur Herstellung von Extrakten
9.9 Trinkwasser
9.10 Legionellen
10 Mikrobiologische Schnellmethoden (
Rapid Microbiological Methods
)
10.1 Bestimmung über den ATP-Gehalt
10.2 Bestimmung über den Einbau von Fluoreszenzmarkern
10.3 Durchflusszytometrie
11 Automation im mikrobiologischen Labor
11.1 Färbeautomaten
11.2 Geräte zur Zählung der Kolonien (KBE)
11.3 Nährmedienabfüllautomat
11.4 Automation des Endotoxintests
12 Qualitätssicherung
12.1 Aufbau eines SOP-Systems
12.2 Schulungen
12.3 Audits und Inspektionen
12.4 Vorgehensweise bei OOS- und OOE-Ergebnissen
13 Identifizierung von Mikroorganismen
13.1 Wachstumskurve
13.2 Generationszeit
13.3 Herstellung von Reinkulturen
13.4 Sensorische und makroskopische Merkmale
13.5 Mikroskopische Untersuchung
13.6 Färbungen
13.7 Prinzip der „bunten Reihe“
13.8 Immunologische Verfahren
13.9 PCR
13.10 Gaschromatografie (FAME)
13.11 FT-IR-Spektroskopie
13.12 MALDI-TOF
14 Reinigung, Sterilisation, Dekontamination und Entsorgung
14.1 Reinigung
14.2 Sterilisation
14.3 Laborreinigung und -desinfektion
14.4 Entsorgung infektiösen Abfalls
14.5 Desinfektionsmaßnahmen bei Havarien
15 Prüfungen im Lohnauftrag (
Outsourcing
)
Mikrobiologische Netzwerke
Adressen
Fachliteratur
Glossar
Stichwortverzeichnis
Endbenutzer-Lizenzvereinbarung
List of Tables
1 Einführung in die Mikrobiologie
Tab. 1.1 Gruppen von Mikroorganismen und biologischen Agenzien.
Tab. 1.2 Größenordnungen von Partikeln und von Zellen.
Tab. 1.3 Lebensbereich für Schimmelpilze. Im mit X gekennzeichneten Bereich ist das Wachstum der Schimmelpilze optimal.
Tab. 1.4 Minimum-Wasseraktivitätswerte (
a
w
) für das Wachstum verschiedener Mikroorganismen. Unterhalb von 0,60 ist kein Wachstum mehr möglich. Zusammenstellung aus [18–21].
Tab. 1.5 Umgebungsbedingungen für Mikroorganismen.
Tab. 1.6 Humanpathogene
Escherichia coli
-Stämme.
Tab. 1.7 Infektionskrankheiten und ihre Übertragungswege, Erreger (auslösendes Agenz) und Infektionsdosen.
Tab. 1.8 Einige Erkrankungen des Menschen und die wahrscheinlichen tierischen Infektionsquellen [9, 32, 33].
2 Rahmenbedingungen für den Betrieb mikrobiologischer Laboratorien
Tab. 2.1 MOPS-Puffer (4-Morpholinpropansulfonsäure-Puffer) zur Kultivierung von
Escherichia coli
. MOPS puffert gut im pH-Wertbereich von 6,5–7,9.
Tab. 2.2 Verschiedene Größen von Petrischalen und ihre Verwendungszwecke.
3 Kalibrierung und Qualifizierung der Geräte
Tab. 3.1 Nennvolumen und Fehlergrenzen bei Kolbenhubpipetten nach DIN EN ISO 8655 Teil 2 [10].
Tab. 3.2 Definierte Temperaturbereiche nach Ph. Eur. und USP.
Tab. 3.3 Im Mikrobiologielabor häufig benötigte Temperaturbereiche.
Tab. 3.4 Korrekturtabelle für den Impaktionssammler MAS 100 NT
®
, der im Sammelkopf eine Siebplatte mit
N
= 300 Löchern, Lochdurchmesser 0,6 mm, enthält [14].
Tab. 3.5 Zusammenstellung von Luftkeimsammelgeräten (Air Sampler) mit Angaben zum Hersteller/Vertreiber, Möglichkeit der isokinetischen Messung, Kalibrierung und einzusetzende Medien. Die Tabelle erhebt keinen Anspruch auf Vollständigkeit.
Tab. 3.6 Kalibrierlösungen nach USP XL (2017), Kapitel 〈1112〉[8].
Tab. 3.7 Empfehlenswerte Kalibrierfrequenzen.
4 Stammhaltung
Tab. 4.1 Zusammenstellung der in der Europäischen Pharmakopöe publizierten Mikroorganismen (nicht vollständig). Eingruppierung in die Risikogruppen nach [1, 2].
Tab. 4.2 Lagerungszeiten verschiedener Mikroorganismen in Abhängigkeit von den angewandten Aufbewahrungstechniken.
5 Betriebshygiene
Tab. 5.1 Mikrobielle Besiedlung des gesunden und des erkrankten Menschen. Zusammengestellt nach [9–13]. Die Bestimmung der Normalflora des Kots geht auf Untersuchungen der NASA zurück.
Tab. 5.2 Reinraumklassen gemäß Annex 1 des EU-Leitfadens der Guten Herstellungspraxis und in Übereinstimmung mit EN ISO 14644-1, Werte „
at rest
“.
Tab. 5.3 Reinraumklassen gemäß Annex 1 des EU-Leitfadens der Guten Herstellungspraxis und in Übereinstimmung mit EN ISO 14644-1, Werte „
in operation
“.
Tab. 5.4 Monitoring und Grenzwerte in den kritischen Bereichen A bis F.
Tab. 5.5 Monitoringfrequenzen in den kritischen Bereichen A bis F.
Tab. 5.6 Abgabe von Partikeln (Hautschuppen) pro Minute durch verschiedene Tätigkeiten und Bewegungen des Menschen [14].
Tab. 5.7 Vergleich von Reinigungs-, Desinfektions- und Sterilisationswirkungen.
Tab. 5.8 Einsatzbereiche und Methoden zur Desinfektion.
Tab. 5.9 Beispiele für Reinigungs- und Desinfektionsmittel für verschiedene Anwendungen.
Tab. 5.10 Wirkstoffe zur Desinfektion unbehüllter und behüllter Viren [18].
Tab. 5.11 Desinfektionsplan für die Mikrobiologischen Laboratorien (Beispiel).
Tab. 5.12 Toxizität der verschiedenen Insektizide für Mensch und Tier [21].
Tab. 5.13 Typische Hygieneschädlinge und Krankheitsüberträger in Mitteleuropa.
6 Umgebungsmonitoring
Tab. 6.1 Gegenüberstellung Reinraum (Teilbarriere) und Isolator (Absolutbarriere).
Tab. 6.2 Gasförmige Sterilisation bzw. Dekontamination.
Tab. 6.3 Ergebnisse der Handschuhprüfungen (Druckprüfung und visuell).
Tab. 6.4 Arbeitstägliches Monitoring der Luft und der Oberflächen im Isolator.
Tab. 6.5 Richt- und Alarmwerte der physikalischen Parameter.
Tab. 6.6 Einschätzung der Kritikalität von Alarmen und Reaktionen darauf.
Tab. 6.7 Reinraumklassifikation nach ISO EN DIN 14644-1:2015 [9]. Angegeben sind die Partikelzahlen pro Kubikmeter.
Tab. 6.8 Anzahl der Messpunkte aus DIN EN ISO 14644-1, 2015 [9].
Tab. 6.9 Auflistung von Luftwechselraten (technische Empfehlung), Überdruck und Erholzeiten, Filtertyp für die Versorgungs- und Umluft in den vier Reinraumklassen.
Tab. 6.10 Mikrobiologisches Umgebungsmonitoring im physikalischen Betrieb.
Tab. 6.11 Auswertung der Befunde über ein Jahr.
Tab. 6.12 Auswertung des Personalmonitorings aus einem Quartal.
Tab. 6.13 Neue Nomenklatur für Pseudomonaden und nah verwandte Mikroorganismen [20].
7 Qualitätskontrolle
Tab. 7.1 Vor- und Nachteile der Endotoxinbestimmungsmethoden aus Ph. Eur., Kapitel 2.6.14.
Tab. 7.2 Verschiedene Endotoxinformulierungen.
Tab. 7.3 Verdünnungstabelle.
Tab. 7.4 Verdünnungstabelle.
Tab. 7.5 Beispiel 1. Geometrischer Mittelwert = 0,24 IU/ml. Aus der Doppelbestimmung ist die letzte positive Verdünnungsstufe 1 : 8, die Verdünnung 1 : 16 ist negativ.
Tab. 7.6 Beispiel 2. Geometrischer Mittelwert = 0,17 IU/ml. Aus der Doppelbestimmung 1 : 4 sind beide Werte positiv, aus der Doppelbestimmung 1 : 8 ist ein Wert positiv und ein Wert negativ, beide Werte aus der Verdünnung 1 : 16 sind negativ.
Tab. 7.7 Im LAL-Test geprüfte Substanzen. Die MVD ist für das augenblicklich eingesetzte Lysat mit einer Empfindlichkeit von 0,03 EU/ml angegeben.
Tab. 7.8 Resultate von 3
In-vitro
-Pyrogen-Tests mit frischem Humanblut (
endotoxin equivalent unit
, EEU). Inkubation vor der Messung 20 h bei 36–38 °C.
Tab. 7.9 Pyrogentest von Vitamin D
3
. Akzeptanzkriterium nach Ph. Eur.: Die Summe darf nicht größer 1,15 °C sein.
Tab. 7.10 Ultrafiltration der Vitaminlösung, Dauer 30 min; Methode: Gel-Clot-Test.
Tab. 7.11 Test mit verschiedenen Endotoxin-Spike-Konzentrationen in der Vitaminlösung; Methode: Gel-Clot-Test.
Tab. 7.12 Test mit verschiedenen Endotoxin-Spike-Konzentrationen in der Vitaminlösung; Methode: MAT (IPT-Kit der Fa. Charles River).
Tab. 7.13 Reagenzien zum Demasking (Bestandteile des Demasking-Kit Endo-RS
®
der Fa. Hyglos, Bernried).
Tab. 7.14 Testorganismen der Ph. Eur., USP und DIN EN ISO.
Tab. 7.15 Anforderungen der Konservierung an Parenteralia und Ophthalmika.
Tab. 7.16 Anforderungen der Konservierung an Topika.
Tab. 7.17 Anforderungen an Oralia. Die Kriterien stellen die empfohlene Wirksamkeit dar.
Tab. 7.18 Zusammenfassende Tabelle für Sterilprodukte, Ophthalmika, Topika.
Tab. 7.19 Beispiel 1 für einen Konservierungsmittelbelastungstest mit den Testergebnissen. Die bakterizide Wirkung von 0,08 % Silbernitrat (oligodynamischer Effekt) wird aufgezeigt.
Tab. 7.20 Beispiel 2 für einen Konservierungsmittelbelastungstest mit den Testergebnissen. Die bakterizide Wirkung von BAC (300 μg/ml) und EDTA (500 μg/ml) in einem Nasalium wird aufgezeigt. Die Kombination von BAC mit EDTA ist sehr effektiv.
Tab. 7.21 Eigenschaften ausgewählter Mykoplasmen, nach [24].
Tab. 7.22 Die wichtigsten human- und tierpathogenen Mykobakterienarten und ihre Hauptwirte, nach [28].
Tab. 7.23 Zusammenstellung mit den von der Ph. Eur., Kapitel 5.1.2 vorgegebenen Bioindikatoren, ergänzt um den sporoziden Dekontaminationsprozess mit VHP™.
Tab. 7.24 Für Vitaminbestimmungen eingesetzte Testorganismen.
Tab. 7.25 Zusammenfassung der Ergebnisse der Untersuchungen an Celluloseprefiltern.
Tab. 7.26 Mikrobiologische Aktionsgrenzen für Primärpackmittel für Arzneimittel.
Tab. 7.27 Gemessene Zellgrößen in WfI und CSB nach ansteigenden Inkubationszeiten.
Tab. 7.28 Bakteriologische Spezifikationen für die eingesetzten Reinigungs- und Desinfektionsmittel.
Tab. 7.29 Prozentuale Verteilung der Labortiere in Deutschland im Jahre 2009 [46]. Die Summe der Tiere beträgt ungefähr 2,8 Millionen.
Tab. 7.30 Zusammenstellung von Daten über die wichtigsten Versuchstiere, nach [49] und ergänzt um [47].
Tab. 7.31 Antibiotika zur Verwendung in der Zellkultur, aus [51], verändert.
Tab. 7.32 Testmikroorganismen (angegeben sind nur die ATCC-Nummern) und Inkubationsbedingungen.
Tab. 7.33 Visuelle Wachstumsprüfung der inokulierten Testorganismen in den Filtrationseinheiten nach Produktfiltration und Überschichtung mit Nährmedium.
Tab. 7.34 Neutralisierende Maßnahmen und Agenzien.
Tab. 7.35 Testkeime und Inkubationsbedingungen zur Validierung von TAMC und TYMC.
Tab. 7.36 Nachweis spezifizierter Mikroorganismen.
Tab. 7.37 Probenvorbereitung zum Nachweis der spezifizierten Mikroorganismen.
Tab. 7.38 Auswertung des quantitativen Nachweises von galletoleranten, gramnegativen Bakterien in 1 g bzw. 1 ml.
Tab. 7.39 Beispielhaft dargestellte Ergebnisse nach Prüfung auf Hemmung (
inhibition
) und Verstärkung (
enhancement
),
λ
= 0,03 IU. Der Test auf Hemmung und Verstärkung ist bestanden, wenn alle vier 2
λ
Spikes positiv und die 0,25
λ
Spikes negativ sind.
Tab. 7.40 Schwellen- und Maximaldosis bei unterschiedlichen Applikationswegen.
8 Prozessvalidierungen
Tab. 8.1 Formaler Ablauf der Prozessvalidierung.
Tab. 8.2 Bakterienkonzentrationen entsprechend MacFarland-Standard (nach bioMerieux).
Tab. 8.3 Anzahl der maximal erlaubten kontaminierten Behältnisse [
k
] bei [
U
] abgefüllten Behältnissen.
Tab. 8.4 Warn- und Aktionslevels für große Zahlen abgefüllter
Media-fill
-Einheiten gemäß JP XV, 2006.
Tab. 8.5 Entpyrogenisierung im Heißluftsterilisator (250 °C, 120 min) bei definierter Maximalbeladung. Vials 1–5 wurden auf dem oberen Ablageboden platziert, Vials 6–10 auf dem unteren Boden. Methode: kinetischchromogener Test, vier Positivkontrollen mit Endotoxin aus
Escherichia coli
O113:H10, geometrischer Mittelwert = 2467 EU/ml, arithmetischer Mittelwert = 2477 EU/ml, Standardabweichung = 300. Bezugsgröße für die Abreicherung ist der geometrische Mittelwert.
Tab. 8.6 Ergebnisse der Durchläufe von zehn endotoxindotierten, parallel angeordneten 10 ml-Glasampullen durch den Entpyrogenisierungstunnel (Breite 40 cm, Temperatur 290 °C, 9600 Ampullen/h). Methode: kinetischturbidimetrischer Test. Positivkontrolle mit
n
= 4 Ampullen, geometrischer Mittelwert 1089 EU/Ampulle.
Tab. 8.7 Beladungsschemata bei zwei Sterilisatoren. Die Pipettendose enthält Glaspipetten, der Drahtkorb Mahlköpfe aus Metall (für Mühlen, die zum Zerkleinern von Tabletten benötigt werden), die Metallboxen enthalten Kleinteile aus Metall wie Spatel und Scheren.
Tab. 8.8 Abtötezeiten bei den Temperaturen 100 °C, 105 °C und 121 °C [10].
Tab. 8.9 Ergebnisse der visuellen Prüfung von 300 analysierten Primärbehältern nach der mikrobiologischen Integritätsprüfung.
Tab. 8.10 Bestimmung der Anzahl vermehrungsfähiger
Pseudomonas aeruginosa
-Zellen aus der Tauchsuspension während der Integritätsprüfung.
Tab. 8.11 Wachstumsprüfung von inokuliertem Medium nach der mikrobiologischen Integritätsprüfung.
Tab. 8.12 Ergebnisse (Mittelwerte der Doppelbestimmung) der Endotoxin-Swabs, kinetisch-turbidimetrischer LAL-Test.
9 Mikrobiologische Untersuchung von Wasser
Tab. 9.1 Im Wasser häufig gefundene Mikroorganismen.
Tab. 9.2 Krankheitserreger, die über das Wasser auf den Menschen übertragen werden können.
Tab. 9.3 Krankheitsausbrüche, verursacht durch kontaminiertes Wasser (Auswahl).
Tab. 9.4 Desinfektionsmittel zur Eliminierung der Mikroorganismen in Biofilmen.
Tab. 9.5 In Biofilmen vertretene Mikroorganismen, nach [7] verändert. 1 = sporadisch, 2 = gelegentlich, 3 = häufig, 4 = sehr häufig, 5 = stets.
Tab. 9.6 Einsatz der verschiedenen Wasserqualitäten.
Tab. 9.7 Nährstoffgehalt der Agarmedien CSA und R2A (beide gemäß Ph. Eur.), Plate Count Agar (PCA) und R2A/R3A.
Tab. 9.8 Aktions-, Warn- und Toleranzlimits für die verschiedenen Wasserqualitäten.
Tab. 9.9 TVO gibt im § 5 Anlage 1 die erlaubten mikrobiologischen Parameter und im § 7 Anlage 3 die Indikatorparameter vor.
Tab. 9.10 Härtebereiche von Trinkwasser.
Tab. 9.11 Typische Verunreinigungen im Trinkwasser [14].
10 Mikrobiologische Schnellmethoden (
Rapid Microbiological Methods
)
Tab. 10.1 Zusammenfassende Tabelle über mikrobiologische Schnellmethoden.
Tab. 10.2
Pseudomonas aeruginosa
, kultiviert in CSB. Bestimmung der Trübung, der Koloniezahl, der Endotoxine (Lysatempfindlichkeit 0,03 EU/ml) und der RLU mit dem Standard Sensitivity Kit.
12 Qualitätssicherung
Tab. 12.1 Gesundheitsbehörden verschiedener Länder weltweit.
Tab. 12.2 Landesgesundheitsbehörden in Deutschland, oberste Landesgesundheitsbehörde im Fettdruck [4].
Tab. 12.3 Auswertung der Prüfung auf Pyrogene nach Ph. Eur., Tab. 2.6.8.1.
13 Identifizierung von Mikroorganismen
Tab. 13.1 Vergleich von Licht- und Elektronenmikroskop.
Tab. 13.2 Gramnegative und grampositive Bakterien und ihre Zellform.
Tab. 13.3 Vorhandensein der verschiedenen Fettsäuretypen in verschiedenen Bakteriengruppen.
Tab. 13.4 Wellenzahlen der durch FT-IR-Spektroskopie nachweisbaren Moleküle.
14 Reinigung, Sterilisation, Dekontamination und Entsorgung
Tab. 14.1 Inaktivierungstemperaturen und -zeiten, bezogen auf feuchte Hitze, Zusammenstellung aus der Literatur [1, 3].
List of Illustrations
1 Einführung in die Mikrobiologie
Abb. 1.1 Weiße Schimmelpilze auf feuchtem Möbelholz im Keller, nach einem Eindringen von Regenwasser.
Abb. 1.2
Aspergillus niger
auf Agarplatte, REM-Aufnahme. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.
Abb. 1.3 Sporenfärbung bei
Bacillus cereus
. Die Sporen sind grün, die vegetativen Zellen rot gefärbt. Vergrößerung 1000×, Immersionsöl. Mit freundlicher Genehmigung von Matthias Nagel, Bremerhaven.
Abb. 1.4 Halobakterien färben eine Saline auf Lanzarote rot. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 1.5 EHEC O157-H7 auf Fibroblast. REM-Aufnahme, Vergrößerung 40 000×. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.
Abb. 1.6
Escherichia coli
-Zelle auf einem Makrophagen. REM-Aufnahme, Vergrößerung 40 000×. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.
2 Rahmenbedingungen für den Betrieb mikrobiologischer Laboratorien
Abb. 2.1
Staphylococcus aureus
. REM-Aufnahme, Vergrößerung 25 000-fach. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde, HZI, Braunschweig.
3 Kalibrierung und Qualifizierung der Geräte
Abb. 3.1 Beispiele für Messgeräteetiketten: Grüne, runde Kalibriersticker, an denen der Kalibriermonat durch Ausschneiden mit einer Spezialzange markiert wird. Blaue Label für nicht zu kalibrierende Geräte (z. B. Vortex, Schüttler, Mühlen, Büretten, bei denen das exakte Entnahmevolumen unwichtig ist), rote Aufkleber für außer Betrieb gesetzte Geräte.
Abb. 3.2 Balkenwaage aus früheren Zeiten.
Abb. 3.3 Ampulle mit externem Thermofühler, daneben der Bioindikotor (Sterikon
®
Ampulle). Mit freundlicher Genehmigung von Udo Zachert, Merck KGaA, Darmstadt.
4 Stammhaltung
Abb. 4.1 Schema der Passagen.
5 Betriebshygiene
Abb. 5.1 Hygieia-Brunnen im Hof des Hamburger Rathauses, errichtet nach der Choleraepidemie 1892 mit fast 17 000 Erkrankten und 8605 Toten. Hygieia steht auf einem Drachen, Symbol für die besiegte Cholera. Der hochgehaltenen Schale entspringt frisches Wasser. Neben der mangelhaften Hygiene in der Altstadt, in der sehr viele Menschen zusammengeballt, zum großen Teil in Kellerwohnungen lebten, war die ungefilterte Entnahme des Elbewassers, das im heißen Sommer des Jahres 1892 ungewöhnlich warm war, zur Verwendung als Trinkwasser maßgeblich für die Epidemie verantwortlich.
Abb. 5.2 Abdruck zweier Finger einer ungewaschenen Hand auf einer Kontaktplatte mit Nährmedium CSA.
Abb. 5.3 Standardisierte Einreibemethode für die hygienische Händedesinfektion nach CEN pr.EN 1500.
Abb. 5.4 Anlegen von Haarnetz, Bart- und Mundschutz.
Abb. 5.5 Einmalkleidung für Besucher und Wartungspersonal in RRK „D“. Overall aus Tyvek
®
, Überschuhe aus Kunststoff und Haarnetz werden benutzt.
Abb. 5.6 Kleidung für Mitarbeiter in RRK „B“. Die benutzte Reinraumkleidung wird gesammelt, gewaschen und sterilisiert.
Abb. 5.7 Laufspuren eines Kornkäfers (
Sitophilus
sp.) auf einer Agarplatte (CSA).
6 Umgebungsmonitoring
Abb. 6.1 Sedimentationsplatte (CSA). Typisch für Bakterien in der Luft (
airborne bacteria
) ist das Vorhanden von Pigmenten, die als UV-Schutz dienen. Daher werden auf Sedimentationsplatten häufig gefärbte Kolonien angetroffen. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 6.2 Verschließbare Kontaktplatten mit CSA und vier Neutralisatoren. Kontakt von optisch sauberen Labortischoberflächen (Edelstahl). Beide Platten wurden nach ihrer Inkubation bei 20–25 °C vier Monate im Kühlschrank (2–8 °C) aufbewahrt, bis sie fotografiert wurden.
Abb. 6.3 Am Beispiel Aqua purificata, Aktionslimit 100 KBE/ml gemäß Ph. Eur. [3], Warnlevel auf 50 % des Aktionslevels und Akzeptanzlevels (Toleranzlevel) auf 30 % festgesetzt.
Abb. 6.4 Verdeutlichung des Warn- und Aktionslevels.
Abb. 6.5 Typische, gelbe Kolonien von
Micrococcus luteus
, mit positiver Katalasereaktion. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 6.6
Micrococcus luteus
im Mikroskop, Vergrößerung 400×, Nikon-Fotomikroskop. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 6.7
Bacillus atrophaeus
auf CSA. Vor der Umbenennung hieß diese Bacillusspezies
Bacillus subtilis (globigii)
.
Abb. 6.8
Bacillus cereus
. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TUDortmund.
Abb. 6.9
Serratia marcescens
auf CSA, isoliert im Umgebungsmonitoring, identifiziert mittels Vitek 2. Blutrote Kolonien wurden bei Isolaten aus dem Monitoring in Reinräumen nicht beobachtet.
Abb. 6.10
Pseudomonas
sp. unter UV-Licht fotografiert. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU-Dortmund.
7 Qualitätskontrolle
Abb. 7.1 Schema der mikrobiologischen Qualitätskontrolle von Solida. Mit freundlicher Genehmigung von Peter Hilgendorf, Pfaffenhofen.
Abb. 7.2 Aktivierungskaskade in den Amoebocyten, getriggert durch Endotoxine (Faktor C-Weg) und 1,3-
β
-D-Glucane (Faktor G-Weg). B
*
, C
*
, G
*
sind die aktivierten Faktoren B, C und G.
Abb. 7.3 Diaporama von Pfeilschwanzkrebsen (Modellen), ausgestellt im Oceanum, Stralsund.
Abb. 7.4 Gelierungsreaktion im Röhrchen: links Gelierung = endotoxinpositive Reaktion. Rechts ist die Probe flüssig geblieben (= endotoxinnegativ).
Abb. 7.5 Benötigte Reagenzien einschließlich humanem Vollblut eines Spenders, Messgerät: Mikrotiterplatten-Reader.
Abb. 7.6 Biokorrosion eines Farblacks. Mit freundlicher Genehmigung von Monika Lamoratta Lanxess, Leverkusen.
Abb. 7.7 Zur Kontrolle des Sterilisationserfolges im Autoklaven: Autoklavenband (Erscheinen von braunen Strichen), Bioindikatorstreifen und Bioindikatorampullen (Sterikon
®
plus). Bei Letzteren bleibt die Farbe des Inhalts rötlich-violett und klar, wenn die Sterilisation erfolgreich war. Anderenfalls erscheint eine Trübung und ein Farbumschlag nach Gelb.
Abb. 7.8 Der Bioindikator
Bacillus stearothermophilus
ist auf runden Stahlplättchen aufgebracht. Die Plättchen liegen am Boden der Röhrchen. Das Foto zeigt die Ergebnisse nach sieben Tagen Inkubation: Röhrchen links außen: Negativkontrolle ohne Bioindikator, keine Trübung. 2. Röhrchen von links: Positivkontrolle mit Bioindikator, ohne sterilisierende Behandlung, Trübung. Alle anderen Röhrchen enthalten den behandelten Bioindikator, keine Trübung, d. h., der Bioindikator wurde abgetötet.
Abb. 7.9 Formel von Gentamicin.
8 Prozessvalidierungen
Abb. 8.1 Auswertearbeitsplatz nach Ph. Eur., Kapitel 2.9.20 „Prüfung auf sichtbare Partikel“. Mit freundlicher Genehmigung von Labor L & S AG, Bad Bocklet.
9 Mikrobiologische Untersuchung von Wasser
Abb. 9.1 Künstlicher Biofilm mit
Pseudoalteromonas ruthenica
auf einer Keramikplatte. REMAufnahme, Vergrößerung 5000-fach. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Lohmeyer, Mikrobiologisches Labor, Münster.
Abb. 9.2 Die Innenwandung des Edelstahlkessels (Volumen 5000 l) zeigt Rouging. Der Kessel wird zur Aufbewahrung von WfI genutzt [13].
Abb. 9.3 Legionellen-Kolonien auf GVPC -Agar. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Lohmeyer, Mikrobiologisches Labor, Münster.
Abb. 9.4 Typische Spiegeleikolonien von
Legionella pneumophilia
. Mit freundlicher Genehmigung von Dr. Lohmeyer, Mikrobiologisches Labor, Münster.
10 Mikrobiologische Schnellmethoden (
Rapid Microbiological Methods
)
Abb. 10.1 Chemische Formel von Adenosin-5’-triphosphat.
Abb. 10.2 Umwandlung von 5(6)-Carboxy-Fluorescein-Diacetat (CFDA) in 6-Carboxy-Fluorescein durch endogene Esterasen. Die chemische Formel zeigt das Molekül 6-Carboxy-Fluorescein.
Abb. 10.3 Fluoreszierende Kolonien von
Aspergillus brasiliensis
. Mit freundlicher Genehmigung von [10].
12 Qualitätssicherung
Abb. 12.1 Fischgrät-Diagramm beispielhaft für den LAL-Test, erstellt mit MS-Visio.
Abb. 12.2 Fehlermöglichkeiten- und Einflussgrößen-Analyse (FMEA) beispielhaft für den LAL-Test.
Abb. 12.3 Fischgrät-Diagramm beispielhaft für die Prüfung auf TAMC und TYMC, erstellt mit MS-Visio.
13 Identifizierung von Mikroorganismen
Abb. 13.1 Phasenkontrast, Vergrößerung 400×. Nikon-Fotomikroskop. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, Universität Dortmund.
Abb. 13.2 Darstellung der Kapsel von
Bacillus megaterium
mit China Ink. Vergrößerung 400×. Nikon Fotomikroskop. Mit freundlicher Genehmigung von Armin Quentmeier, TU Dortmund.
Abb. 13.3 Modifizierte Gramfärbung von
Escherichia coli
(gramnegativ, rot) und
Staphylococcus aureus
(grampositiv, blau) mit phenolfreien Reagenzien. Mit freundlicher Genehmigung von Daniela Grabis (Merck KGaA, Darmstadt).
14 Reinigung, Sterilisation, Dekontamination und Entsorgung
Abb. 14.1 Sinnerscher Kreis.
Abb. 14.2 Gasbildung in einer Konservendose („Bombage“), hervorgerufen durch Gärung von anaeroben Clostridien. Der Dosendeckel ist im Normalfall wegen des herrschenden Unterdrucks nach innen gewölbt. Mit freundlicher Genehmigung von Matthias Nagel, Bremerhaven.
Adressen
Abb. 17.1 BfArM in Bonn-Bad Godesberg.
Abb. 17.2 EDQM in Strasbourg.
Abb. 17.3 Das Paul-Ehrlich-Institut in Langen (Hessen).
Abb. 17.4 Das Robert Koch-Institut in Berlin.
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Michael Rieth
Pharmazeutische Mikrobiologie
Qualitätssicherung, Monitoring, Betriebshygiene
2., aktualisierte und ergänzte Auflage
Autor
Michael RiethMerck KGaALS-QRB Biological MaterialsFrankfurter Str. 25064293 DarmstadtDeutschland
TitelbildVeronika Emendörfer/VEROwww.veronika-emendoerfer.de
2. Auflage 2017
Alle Bücher von Wiley-VCH werden sorgfältig erarbeitet. Dennoch übernehmen Autoren, Herausgeber und Verlag in keinem Fall, einschließlich des vorliegenden Werkes, für die Richtigkeit von Angaben, Hinweisen und Ratschlägen sowie für eventuelle Druckfehler irgendeine Haftung.
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© 2017 WILEY-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Boschstr. 12, 69469 Weinheim, Germany
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Umschlaggestaltung Adam Design, Weinheim, Deutschland
Satz le-tex publishing services GmbH, Leipzig, Deutschland
Print ISBN 978-3-527-34335-5ePDF ISBN 978-3-527-81052-9ePub ISBN 978-3-527-81050-5Mobi ISBN 978-3-527-81051-2oBook ISBN 978-3-527-81049-9
„Qualität ist kein Zufall; sie ist immer das Ergebnis angestrengten Denkens.“John Ruskin (1819–1900), englischer Philosoph und Schriftsteller
Vorwort zur zweiten Auflage
Für die zweite Auflage der „Pharmazeutischen Mikrobiologie“ werden die momentan aktuellen Themen „low endotoxin recovery“ und „Maskierung/Demaskierung“ in das Kapitel über den Endotoxintest aufgenommen. Wo immer möglich, werden die Bezüge zu den neuen Ausgaben der Arzneibücher Ph. Eur. 9 und USP 40/NF 35 hergestellt. Die Kapitel über den media fill und über das Wasser sind aktualisiert, das Kapitel über den Konservierungsmittelbelastungstest ist ergänzt und der Bezug zur ISO-Norm hergestellt. Die Literaturverzeichnisse sind fortgeführt, Literatur vor dem Jahre 2000 ist, sofern möglich, fortgelassen worden. Ferner erhöht sich die Anzahl der Abbildungen deutlich, die Fotos werden überwiegend in Farbe gedruckt. Viele Bilder von Bakterien (Mikroskopaufnahmen und Abbildungen von Kolonien auf der Petrischale) hat mir Herr Dr. Armin Quentmeier/TU Dortmund zur Verfügung gestellt; weitere Fotos stammen von Herrn Dr. Michael Lohmeyer/Mikrobiologisches Labor Dr. Lohmeyer, Münster, und vom Labor L + S AG, Bad Bocklet. Allen sei herzlich gedankt!
Schließlich sind die Druckfehler korrigiert. Hier danke ich auch Herrn Dr. Marcel Goverde für seine Hinweise.
Das neue Titelbild gestaltet wiederum die Darmstädter Künstlerin Veronika Emendörfer/VERO, der ich herzlich danke.
Darmstadt, im Dezember 2016
Michael Rieth
Vorwort zur ersten Auflage
In dem vorliegenden Buch werden die Aufgaben und Tätigkeiten der in den mikrobiologischen Laboren der pharmazeutischen Qualitätssicherung arbeitenden Biologielaboranten und Mikrobiologen beschrieben. Schwerpunkte sind die Methoden der Qualitätskontrollprüfungen einschließlich ihrer Validierungen, die Qualifizierungen und Kalibrierungen der dazu benötigten Geräte und Messinstrumente, das Umgebungsmonitoring in der Pharma- und Chemieproduktion sowie die Betriebshygiene. Eine derartige Zusammenfassung fehlte bisher in der deutschsprachigen Fachliteratur. Vorgestellt werden in erster Linie bakteriologische Methoden und Verfahren, jedoch werden auch Verweise auf Zellkulturmethoden und Tiermodelle gegeben. Moderne Techniken, Schlagwort „rapid microbiological methods“ werden ebenfalls vorgestellt. Vor allem bei Verfahren mit langen Inkubationszeiten wie beim Steriltest und der Prüfung auf Mykobakterien und Mykoplasmen werden kürzere Analysenzeiten benötigt. Die Zukunft wird zeigen, ob diese Verfahren die klassischen Kultivierungstechniken, die größtenteils auf Robert Koch und andere Bakteriologen des späten 19. Jahrhunderts zurückgehen, dauerhaft ersetzen können.
Herzlich danke ich folgenden Kolleginnen und Kollegen für die Überlassung von Fotos und Abbildungen: Daniela Grabis (Merck KGaA), Monika Lamoratta (Lanxess Deutschland GmbH, Leverkusen), Peter Hilgendorf (Daiichi Sankyo Europe GmbH, Pfaffenhofen), Matthias Nagel (Hochschule Bremerhaven), Armin Quentmeier (Universität Dortmund) und Manfred Rohde (Helmholtz-Zentrum für Infektionskrankheiten, Braunschweig). Barbara Gerten (Merck KGaA) danke ich für wertvolle Anregungen und Literaturhinweise.
Ganz besonders danke ich der Künstlerin Veronika Emendörfer/VERO für das Titelbild.
Darmstadt, im Januar 2012
Michael Rieth
Abkürzungen
AL
Aktionslimit (Aktionslevel)
AMG
Arzneimittelgesetz
AMWHV
Arzneimittel- und Wirkstoffherstellungsverordnung
AP
Aqua purificata
API
analytical process index
at
Atmosphäre
ATCC
American Type Culture Collection
ATP
Adenosin-5′-triphosphat
a
w
Wasseraktivität
BBS
Beauftragter für Biologische Sicherheit
BfArM
Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte
BG
Berufsgenossenschaft
BG RCI
Berufsgenossenschaft Rohstoffe und Chemische Industrie
BiostoffV
Biostoffverordnung
BLV
Bundesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
BMELV
Bundesministerium für Ernährung, Landwirtschaft und Verbraucherschutz
BMwA
Bundesamt für wirtschaftliche Angelegenheiten (Österreich)
BP
British Pharmacopeia oder bubble point
BPLS
Brilliantgrün Phenolrot Laktose Saccharose Nährmedium
BSE
Bovine spongiforme Enzephalopathie
CCIT
container closure integrity test
CCOS
Culture Collection of Switzerland
CDC
Centers for Disease Control and Protection
CDCP
Centers for Disease Control and Prevention
CFDA
5(6)-Carboxy-Fluorescein-Diacetat
CHCA
α
-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
cft
cubic feet
CIP
Collection de l’Ínstitut Pasteur oder cleaning in place
CLED
Cystein-Lactose-Elektrolyt-defizientes Nährmedium
cm
Zentimeter
CPM
Curriculum für pharmazeutische Mikrobiologie
CSA
Casein-Sojamehlpepton-Agar (= TSA)
CSB
Casein-Sojamehlpepton-Bouillon (= TSB)
d
Tag oder Durchmesser
Da
Dalton, Einheit der relativen molaren Masse, 1 Da = 1,66018 × 10
−24
g
DAB
Deutsches Arzneibuch
DAkkS
Deutsche Akkreditierungsstelle
DAPI
4′,6-Diamidin-2-phenylindol
DEHS
Diethylhexylsebacinsäure
DEV
Deutsches Einheitsverfahren
DGFM
Deutsche Gesellschaft für Mykologie e. V.
DGHM
Deutsche Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie e. V.
DIF
Direkte Immunfluoreszenz
DIMDI
Deutsches Institut für Medizinische Dokumentation und Information
DIN
Deutsche Industrienorm
DKD
Deutscher Kalibrierdienst
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DOP
Dioctylphthalat
DQS
Deutsche Gesellschaft zur Zertifizierung von Managementsystemen
DSM
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen
DSMZ
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
EAM
Eidgenössisches Amt des Messwesens (Schweiz)
ECCO
European Culture Collections Organization
EDQM
European Directorate for the Quality of Medicines and Healthcare
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EE
Endotoxineinheiten
EEU
endotoxin equivalent unit
EHEC
enterohämorrhagische
Escherichia coli
ELC
endotoxin limit concentration
ELISA
enzyme-linked immuno sorbent assay
EtOH
Ethanol
EU
endotoxin unit (1 EU = 1 EE = 1 IU = 1 IE)
FAME
fatty acid methyl ester
FDA
Food and Drug Administration
FLI
Friedrich-Löffler-Institut
GBF
Gesellschaft für Biotechnologische Forschung
GenTG
Gentechnikgesetz
GLP
good laboratory practice
GMP
good manufacturing practice
GSF
Gesellschaft für Strahlen- und Umweltforschung
GVPC
Glycin-, Vancomicin-, Polymixin-, Cycloheximidagar
h
Stunde
HEPA
high efficiency particulate airfilter
HPW
highly purified water
HRP
horseraddish peroxidase
HUS
hämolytisch-urämisches Syndrom
HZI
Helmholtz-Zentrum für Infektionskrankheiten GmbH
IDA
International Depositary Authority
IfSG
Infektionsschutzgesetz
IPA
Isopropylalkohol
IPT
In-vitro
-Pyrogen-Test
IQ
installation qualification
ISO
International Standardization Organization
IU
Internationale Einheiten
IVSS
Internationale Vereinigung für Soziale Sicherheit
JP
Japanische Pharmakopöe
KBE
Koloniebildende Einheiten (engl. CFU, colony forming units)
λ
Lysatempfindlichkeit Lambda
l
Liter
LAL
Limulus Amoebocyten Lysat
LER
low endotoxin recovery
LF
laminar flow
LMX
Laurylsulfat MUG X-Galaktopyranosid
LPS
Lipopolysaccharid
LRW
LAL-Reagenz-Wasser (Ph. Eur.: Wasser zur BEP) oder limulus reagent water
LTA
lipoteichoic acid (Lipoteichonsäure)
MALDI/TOF
matrix-assisted laser desorption/ionization – time of flight
MAT
Monozytenaktivierungstest
m-CP
modifizierter Cellobiose-Polymixin B-Agar
min
Minute
MPG
Medizinproduktegesetz
MRI
Max-Rubner-Institut
MRS
Lactobacillus-Agar nach de Man, Rogosa und Sharpe
MVD
maximum valid dilution
NAT
Amplifikation von Nukleinsäuren
NCTC
National Collection of Type Cultures
NCYC
National Collection of Yeast Cultures
OB
Objektträger
OOC
out of calibration
OD
optische Dichte
ODC
Ornithindecarboxylase
ÖKD
Österreichischer Kalibrierdienst
OF
Oxidation/Fermentation
ONGP
o
-Nitrophenyl-
β
-D-galactopyranosid
OOE
out of expectation
OOL
out of limit/out of level
OOS
out of specification
OOT
out of trend
PAO
Polyalphaolefine
PBS
phosphatgepufferte Saline
PCR
Pseudoselagar oder Polymerasekettenreaktion
PDA
Parenteral Drug Association
PEI
Paul-Ehrlich-Institut
Ph. Eur.
Europäische Pharmakopöe
pNA
p
-Nitroanilin
POD
Peroxidase
PPC, PPK
Produktpositivkontrolle
PSA
persönliche Schutzausrüstung
PVP
Polyvinylpyrrolidon (= Povidon)
PVDF
Polyvinylidenfluorid
PTB
Physikalisch Technische Bundesanstalt
RCM
reinforced clostridial medium
REM
Rasterelektronenmikroskopie
RIA
Radioimmunoassay
RKI
Robert-Koch-Institut
RLU
relative light unit oder relative Lichteinheiten
RNA
Ribonukleinsäure
RRK
Reinraumklasse
s
Sekunde
SAL
sterility assurance level
SARS
severe acute respiratory syndrome
SAS
Swiss Accreditation Service
SDA
Sabouraud-Dextrose-Agar
SIM
Sulfid- und Indolbildung, Motilität
SOP
standard operation procedure (Standardarbeitsanweisung)
TAMC
total aerobic microbial count
TEM
Transmissionselektronenmikroskopie
TierSeuchErV
Tierseuchenerregerverordnung
TMB
Tetramethylbenzidin
TRBA
Technische Regeln Biologische Arbeitsstoffe
TrinkwasserV
Trinkwasserverordnung
TSA
tryptic soybean agar
TSB
tryptic soybean bouillon
TTC
Triphenyltetrazoliumchlorid
TÜV
Technischer Überwachungsverein
TVO
(deutsche) Trinkwasserverordnung
TYMC
total yeast and mould count
UF
Ultrafiltration
Upm
Umdrehungen pro Minute
UPU
Weltpostunion
USP
United States Pharmacopeia
UVV
Unfallverhütungsvorschrift
VAAM
Vereinigung für Allgemeine und Angewandte Mikrobiologie
VAH
Verbund Angewandte Hygiene
VBG
Verordnung der Berufsgenossenschaft
VBNC
viable but non-culturable
VE
vollentsalzt
VfA
Verband forschender Arzneimittelhersteller e. V.
VHP
vaporized hydrogen peroxide (gasförmiges Wasserstoffperoxid)
VI
Vorbeugende Instandhaltung
VRBA
violet red bile agar
VRBD
violet red bile dextrose (Kristallviolett-Neutralrot-Galle-Dextrose)
WFCC
World Federation for Culture Collections
WfI
Wasser für Injektionszwecke
WL
Warnlimit
WHO
World Health Organization
WST
working standard
XLD
Xylose-Lysin-Deoxycholat-Agar
ZEBET
Zentralstelle zur Erfassung und Bewertung von Ersatz- und Ergänzungsmethoden zum Tierversuch
ZLG
Zentralstelle der Länder für Gesundheitsschutz bei Arzneimitteln und Medizinprodukten
1Einführung in die Mikrobiologie
Zur Einführung in die Welt der Mikrobiologie und Hygiene soll das Gedicht „Überall Bakterien!“ von Alexander Moszkowski stehen, geschrieben im Berliner Dialekt und erschienen in der populären Zeitschrift „Fliegende Blätter“ in Berlin im Jahre 1887:
„Nee, ick sag schon! von Bakterien
Krebse, rechte scheene, jroße!
Hat man früher nischt jewußt,
Wie jesund det früher war!
Da war’s Essen noch ’ne Freude
Heute jibt es Krebsbazillen
Und det Trinken war ’ne Lust;
In dem Oderkrebs sogar;
Aber seit man die Bazillen
Hat man sechs Stück ufjeprepelt,
Und dergleichen Zeugs erfund,
Denkt man jleich: Schockschwerenot,
Is der Mensch total jeliefert,
Warum is mich denn so übel?
Allens is jetzt unjesund.
Nächsten Morgen is man dot.
Les’ ick da, det äußerst jiftig
Ooch det Atmen is jefährlich:
Heutzutag Vanillen-Eis;
Wenn ick gut dir raten kann.
Früher aß man’s mit Verjnügen
Mitmensch, atme nich zu ville.
Jeden Sommer massenweiß;
Sieh dir erst die Luft mal an;
Heute is selbst die Vanille
Kommst de in so’n Pilzjewimmel,
Vom Bazillenherd bedroht,
Hilft dir keen Karbol und Jod,
Schmecken dut se ausjezeichnet,
Ziehste in den janzen Schimmel,
Aber nachher is man dot.
Fällst um un biste dot.
Jrüne Aale, sonst det Beste
Holste dir ’nen netten Schmöker
Wo der Mensch nur haben kann,
Aus der Leihbibliapothek,
Sind nu ooch nich zu jebrauchen,
Kriegste gleich ’n Schock Milliarden
Seit der Fischbazillus dran;
Von Mikroben uf’n Weg;
Ißt se eener mit Verjnügen
Kommste uf de vierte Seite,
An der Spree zum Abendbrot,
Wirste im Jesichte rot,
Liejt er jleich in letzten Zügen, –
Uf der fünften kriegste’s Fieber,
Zehn Minuten später: dot.
Bei der sechsten biste dot.
Det ick mit de Hochbahn rutsche
Nee, ick sag’schon! Von dem Leben
Kommt mir niemals in den Sinn;
Hat man jarnischt, wie Verdruß,
Nee, in die Bazillenkutsche
Weil man die verfluchten Dinger
Da kriegt mir keen Deibel rin!
Immerzu verschlucken muß!
Steigste in fidel und munter,
Alle Dage muß man lesen,
Pletzlich spürste Atemnot,
Wie det Kleinzeug uns bedroht,
Fährste bis zum Zoo hinunter
Und wir jroßen Lebewesen
Steigste aus und biste dot.
Fallen um – schwapp – mausedot!“
1.1 Historisches
Nur wenige Jahre nach den ersten Beschreibungen und Isolierungen von Mikroorganismen durch Louis Pasteur, Robert Koch, Gerhard Hansen und anderen war der Öffentlichkeit schon eine wesentliche Eigenschaft dieser meist einzelligen Kleinstlebewesen bekannt: Sie sind ubiquitär verbreitet, d. h. überall! Auch dass sie im Körper von Mensch und Tier Fieber erzeugen oder Krankheiten hervorrufen können, teilweise mit Todesfolge, war bekannt, ebenso schon Desinfektionsmaßnahmen wie der Einsatz der erwähnten Agenzien Karbolsäure und Jod. Auch der Name „Bakterien“ ist in dem Gedicht korrekt wiedergegeben. Noch 1906 wird in der 8. Auflage des „Lehrbuchs der Botanik für Hochschulen“ von Eduard Straßburger et al. neben anderen Bezeichnungen von Spaltpilzen (Schizomycetes) geschrieben, die Cyanobakterien werden als Spaltalgen bezeichnet [1].
Der Mensch macht sich die Leistungen der Mikroorganismen seit Jahrtausenden zunutze, ohne jedoch sehr lange Zeit von ihrer Existenz zu wissen. Die Sumerer brauten bereits vor 5000 Jahren ein bierähnliches Getränk, und die Assyrer ließen vor ungefähr 3500 Jahren Traubensaft zu Wein vergären.
Der erste Mensch, der Mikroorganismen mit eigenen Augen sah, war wohl der holländische Tuchhändler Antony van Leeuwenhoek (1632–1723). Er experimentierte mit selbstgebauten, einlinsigen Mikroskopen, mit denen er Vergrößerungen bis 270-fach und Auflösungen bis 1,5μm erreichte. 1675 untersuchte er einen Aufguss von Pfefferkörnern und entdeckte winzige „Tierchen“. Weitere dieser damals „animalcula“ genannten kleinen Lebewesen entdeckte er im Zahnbelag. Darüber erstellte van Leeuwenhoek Zeichnungen, die er 1683 per Brief an die Royal Society nach London schickte [2].
Dem französischen Chemiker Louis Pasteur (1822–1895) gelangen gleich mehrere bahnbrechende Erkenntnisse auf dem Feld der Mikrobiologie. Er widerlegte experimentell die Urzeugungshypothese, erklärte das Wesen der Fermentation am Beispiel der alkoholischen Gärung und der Milchsäuregärung, entwickelte Methoden zur Desinfektion und Sterilisation und führte Verfahren zur Bekämpfung von Infektionskrankheiten durch Impfung ein (Beispiel Tollwutimpfung 1885).
Der norwegische Arzt Gerhard Hansen (1841–1912) entdeckte 1873 mikroskopisch den Erreger der Lepra, Mycobacterium leprae, als eines der ersten Bakterien, die als Krankheitserreger erkannt wurden [3]. Dieses Bakterium ist bis heute in Nährmedien nicht kultivierbar. Die Diagnose geschieht mit dem Mikroskop an Biopsiematerial oder Geschabsel der Nasenschleimhaut. Die Vermehrung dieser Mykobakterien gelingt nur in der Pfote von Mäusen und im Gürteltier (Armadillo). Erregerspezifische DNA lässt sich mithilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) nachweisen.
Der deutsche Arzt Robert Koch (1843–1910) bewies 1876 am Beispiel des Milzbranderregers Bacillus anthracis, dass Mikroorganismen die Verursacher von Infektionskrankheiten sind. Er stellte vier Postulate auf:
Bakterien müssen im infizierten Organismus nachweisbar sein.
Diese Bakterien müssen isoliert und in Reinkultur gebracht werden.
Durch Infektion mit diesen isolierten Bakterien wird im gesunden Organismus die Krankheit wieder hervorgerufen.
Der gleiche Infektionserreger ist erneut aus dem Wirt isolierbar.
Koch entwickelte Nährmedien, z. B. Fleischextraktbouillon, die er anfänglich mit Gelatine verfestigte, später mit Agar-Agar. Das kochsche Plattengussverfahren, bis zum heutigen Tage in allen bakteriologischen Laboren angewandt, geht auf ihn zurück.
Mikroorganismen werden in zwei eigenen taxonomischen Domänen zusammengefasst (Bacteria und Archaea) und so von der Domäne Eukarya (Pilze, Tiere und Pflanzen) abgehoben. Aufgrund des Zellaufbaus der Mikroorganismen werden sie in Prokaryonten (Bakteria und Archaea; griech. bakteria = Stab; griech. archaios = alt, ursprünglich) und Eukaryonten (Pilze, Hefen, Algen, Protozoen) unterteilt.
1.2 Bedeutung
Die medizinische Mikrobiologie befasst sich mit der Erforschung der für Mensch und Tier bedeutungsvollen Krankheitserreger, deren Lebensgewohnheiten und Auswirkungen auf den menschlichen bzw. tierischen Organismus; sie beschäftigt sich somit vorwiegend mit den obligat pathogenen (= in jedem Fall krankmachenden) und den fakultativ pathogenen (= unter Umständen krankmachenden) Mikroorganismen, d. h. mit Keimen, die durch Zellzerstörung oder durch Abgabe giftiger Stoffwechselprodukte als gefährlich oder als „Schädlinge“ anzusehen sind. Mikroorganismen sind aber im Allgemeinen viel eher als „Nützlinge“ zu bezeichnen; ein biologisches Gleichgewicht ohne Mikroorganismen ist überhaupt nicht möglich. Sie sorgen durch die Mineralisation von organischer Substanz (z. B. pflanzlichem Material) für eine Wiedergewinnung von Kohlenstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor usw., die dann erneut den Pflanzen zur Verfügung stehen (Stoffkreisläufe). Im Magen-Darm-Trakt von Mensch und Tier kommen den Mikroorganismen wichtige Funktionen bei Aufschluss und Verdauung der Nahrung zu. Auch Haut und Schleimhäute der Menschen sind besiedelt. Zur Verdeutlichung der Größenordnungen: Ein Mensch besteht aus ca. 1013 Zellen. Im Magen-Darm-Trakt leben ca. 1014 und auf der Haut ca. 1012 Mikroorganismen, die zusammen ca. 1,25 kg wiegen [4]. Damit beherbergt der menschliche Körper mehr Mikroorganismen als er selbst an eigenen Zellen verfügt.
Mikroorganismen finden Anwendung in der Lebensmittelindustrie. Beispiele dafür sind:
Hefen bei der Fabrikation von Brot, Bier, Sake und Wein,
Milchsäurebakterien bei der Herstellung von Joghurt, Kefir, Sauerkraut, Salami,
Essigsäurebakterien für die Zubereitung von Essig,
Schimmelpilze bei der Käseproduktion (Gorgonzola, Roquefort usw.) und für die Aufbereitung von Sojabohnen (in Ostasien).
Mikroorganismen werden eingesetzt zur Gewinnung von:
Vitaminen,
Aminosäuren,
Hormonen,
Steroiden,
Enzymen, z. B. Amylasen (Stärkespaltung), Proteasen (Verdauung, Ledergerbung),
Lipasen (Fettspaltung), Pektinasen (Fruchtsaftklärung),
Antibiotika,
Alkoholen (Ethanol, Butanol, Butandiol, Glycerin usw.) und
weiteren Wirkstoffen, die zum Teil auch durch genetisch veränderte Mikroorganismen produziert werden (z.B. Insulin).
Mikroorganismen sind bei der Aufbereitung von Abwasser und der Müllkompostierung unerlässlich.
1.3 Mikroorganismengruppen
Eine Übersicht über die verschiedenen Gruppierungen von Mikroorganismen und über weitere Erreger von Infektionskrankheiten vermittelt Tab. 1.1. Mikroorganismen sind mit bloßem Auge nicht sichtbar; für ihre Beobachtung benötigt man ein Lichtmikroskop, im Falle der Viren – bis auf ganz wenige Ausnahmen – ein noch stärker vergrößerndes Elektronenmikroskop.
Die mittlere Größe von Bakterien liegt zwischen 0,3 und 10 μm. Der Durchmesser von Kokken, die zur Hautflora des Menschen gehören, beträgt ca. 1 μm. Denkt man sich 500 Kokken dieser Größe aneinandergereiht, so würde der Durchmesser des Punktes am Satzende erreicht. Ein weiterer Größenvergleich: Ein Kopfhaar ist ca. 40–120 μm, im Mittel 80 μm, dick (siehe Tab. 1.2). Das menschliche Auge kann Gegenstände bis ca. 25 μm erkennen (Auflösungsvermögen).
Tab. 1.1Gruppen von Mikroorganismen und biologischen Agenzien.
Subzelluläre biologische Objekte
Meist einzellige Lebewesen (Mikroorganismen)
Prionen
Prokaryonten:
Viroide
Eubakterien
Bakteriophagen
Chlamydien
Viren
Rickettsien
Mykoplasmen
Archaeen
Eukaryonten:
Pilze, Hefen, Algen, Protozoen
Tab. 1.2 Größenordnungen von Partikeln und von Zellen.
Zelle bzw. Partikel
Größe
Eizelle (Vogel)
Im Zentimeter-Bereich (Straußenei:
d
= 15 cm)
Eizelle (Mensch)
200 μm
Menschliches Haar
d
= 40−120 μm, durchschnittlich 80 μm
Menschliche und tierische Zellen
20–30 μm
Menschlicher Erythrozyt
7,5 μm
Menschliche Samenzelle
6,5 μm lang
Pollen
7–100 μm
Staub
0,1–100 μm
Aerosol beim Niesen
10–300 μm
Protozoen
5–150 μm
Pilze
5–10 μm
Bakterien
0,3–10 μm
Nanobacterium equitum
(Archaeon)
0,4 μm
Mykoplasmen
0,3–0,8 μm
Chlamydien
0,3–1,0 μm
Rickettsien
0,5–1,0 μm
Viren
0,016–2,0 μm
Viroide
2 × 40 nm
Makromoleküle
1–10 nm
Prionen
<
5 nm
Atome
0,1 nm
d = Durchmesser.
Die Welt der Mikroorganismen besteht aus den folgenden Gruppierungen (wobei es sich bei den folgenden ersten drei Gruppierungen nicht im eigentlichen Sinn um Lebewesen handelt, sondern um biologische Agenzien).
Prionen
Infektiöse Prionen PrPsc sind fehlgefaltete Formen eines kleinen (molare Masse ca. 30 000 Da) zellulären Glycoproteins. Die Fehlfaltung findet beim Rind zwischen den Aminosäuren 121 und 230 statt und ist einem Proteaseverdau nicht mehr zugänglich [5]. Den Namen leitete Stanley Prusiner von „proteinaceous infectious particle“ ab [6]. PrPsc verursacht Erkrankungen bei Schafen und Ziegen (engl. scrapie, dtsch. Traberkrankheit), Rindern bzw. Katzen (bovine bzw. feline spongiforme Enzephalopathie = BSE bzw. FSE), Nerzen, Hirschen und Huftieren. Auch der Mensch kann infiziert werden (Kuru, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom). Die Inkubationszeiten können viele Jahre dauern. Im Verlauf dieser Erkrankungen zerfällt das Hirngewebe schwammartig (= spongiform). BSE trat gegen Ende der 1980er-Jahre im größeren Maßstab erstmals in Großbritannien auf, während Scrapie bereits seit mehr als 260 Jahren bekannt ist [7]. Vermutlich wurden die Prionen über unzureichend erhitztes Tiermehl, das PrPsc aus an Scrapie infizierten Schafen enthielt und das an Rinder verfüttert wurde, übertragen.
Viroide
Viroide sind zirkuläre, einsträngige RNA-Moleküle von niedriger molarer Masse (ca. 12 × 104 Da, ca. 360 Nukleotide). Die RNA ist „nackt“, d. h. nicht von Protein umhüllt. Viroide verursachen Pflanzenkrankheiten, z. B. die Spindelknollensucht der Kartoffel (potato spindle tuber viroid).
Viren
Viren (lat. virus = Gift, Schleim) sind überwiegend ultramikroskopische, obligate Zellparasiten, die nur entweder DNA (z. B. Pockenvirus, Herpes simplex) oder RNA (z. B. Grippe-, Schnupfen-, Tollwutviren) enthalten, keine Enzymsysteme zur Energiegewinnung und keine Systeme zur Proteinsynthese aufweisen und infizierte Wirtszellen zur Synthese der Virusbausteine veranlassen. Viren bestehen mindestens aus einem nukleinsäurehaltigen Innenkörper und einem Proteinmantel, Kapsid genannt. Sie können behüllt, d. h. mit einer Lipiddoppelschicht umgeben sein (wie die Krankheitserreger von Pocken, Herpes, Masern, Grippe, Tollwut, AIDS und SARS) oder unbehüllt sein (z. B. Erreger von Polio, Hepatitis A, Schnupfen und Maul- und Klauenseuche). Das Polio-Virus lässt sich mit der chemischen Summenformel C332 652H492 388N98 245O131 196P7501S2340 charakterisieren [8]. Am 9.12.1979 erklärte die WHO die Welt als pockenfrei.
Die Größe der Viren variiert zwischen 20 nm (Picornaviren, Arboviren) und 2000 nm (Pflanzenviren wie das Citrus-Tristeza-Virus). Viren, die Bakterien befallen, heißen Bakteriophagen. Molekularbiologisch gut untersucht sind die T-Phagen (Coli-Phagen); ihre Größe beträgt 70 nm × 200 nm.
2003 wurden große Viren in Amöben gefunden; sie wurden Mimiviren genannt. Mit Größen bis 800 nm sind sie im Lichtmikroskop sichtbar [8]. Der Nachweis von Viren geschieht mithilfe von Gewebekulturen, Tierversuchen, Eikulturverfahren, PCR und immunologischen Methoden. Bekannt sind zurzeit ungefähr 1500 Viren, von denen etwas mehr als 200 humanpathogen sind [9].
Archaeen
Archaeen (griech. archaios für alt, ursprünglich) leben an extremen Standorten, beispielsweise in Salzseen (z. B. Totes Meer mit ca. 30 % an verschiedenen Salzen, entspricht einem aw-Wert von 0,75), heißen Schwefelquellen und in der Tiefsee. Zu den Archaeen zählen methanogene (produzieren Methan, CH4), thermophile (leben bei hohen Umgebungstemperaturen) und halophile Vertreter. Ihre Zellwand ist anders aufgebaut als die der Bakterien. Bis jetzt wurden über 250 Arten von Archaeen beschrieben, wobei pathogene Vertreter bisher nicht bekannt sind [9].
Der kleinste Vertreter der Archaeen ist Nanoarchaeum equitum. Dieser Organismus besitzt zwar eigene Ribosomen, ein Teil der Stoffwechselfunktionen nutzt er von der Wirtszelle. Archaeen wurden 1977 von dem amerikanischen Mikrobiologen C.R. Woese als eigenes Bakterienreich (Domäne) definiert [10].
Bakterien
Bakterien vermehren sich ungeschlechtlich durch Querteilung. Sie besitzen eine starre, unterschiedlich dicke, Form und Stabilität garantierende Zellwand. Die Kernstruktur (die kein echter Zellkern ist) wird als Nukleoid bezeichnet. Inzwischen wurden über 1000 bakterielle Genome sequenziert (die erste Sequenzanalyse gelang 1995 am Genom von Haemophilus influencae). Bisher wurden ungefähr 10 000 Bakterienspezies beschrieben [11], jährlich kommen mehrere Hundert hinzu. Ungefähr 340, also 3,4% der bisher bekannten Arten sind humanpathogen, und unter den Todesursachen belegen Infektionskrankheiten den zweiten Platz, wobei auf Platz eins die Folgen des Tabakkonsums stehen [12].
Chlamydien
Sie sind obligate Zellparasiten, die alle typischen Strukturelemente der Bakterien besitzen. Die Chlamydien durchlaufen einen Entwicklungszyklus (von den 0,3 μm großen Elementarkörperchen zu den 1 μm großen Initialkörperchen). Ein Beispiel ist der Erreger der Papageienkrankheit Psittakose, Chlamydia psittaci, der auch Menschen befallen kann, wobei sich grippeähnliche Symptome ausbilden. Die Infektion passiert durch Einatmen von chlamydienhaltigem Staub aus Vogelexkrementen. Viele Tauben in den Städten sind mit Chlamydia infiziert.
Rickettsien
Sie sind ebenfalls obligate Zellparasiten von 0,5–1 μm Größe. Ihre Vermehrung erfolgt durch Querteilung mithilfe von Kofaktoren der Wirtszelle. Ein Beispiel ist der Erreger des Fleckfiebers, Rickettsia prowazekii. Die Bakterien werden durch Zecken, Milben, Läuse und Flöhe übertragen. Ein weiterer Erreger ist Coxiella burnettii. Haus-und Wildtiere werden durch Zeckenbiss angesteckt. Der Mensch infiziert sich durch coxiellahaltigen Staub von tierischen Exkrementen. Die Krankheit heißt Q-Fieber, ihre Diagnose wird serologisch erhoben.
Mykoplasmen
Zu dieser Gruppe gehören Bakterien ohne starre Zellwand; dadurch erscheinen sie polymorph und zeigen eine hohe Plastizität. Ihre Größe beträgt 0,3–0,8 μm. Beispiele sind die Erreger von Pneumonien, Mycoplasma pneumoniae, und Harnwegsinfektionen, Ureaplasma urealyticum. Zur Normalflora gehören Mycolasma buccale (auf der Mundschleimhaut) und Mycoplasma hominis (auf der Schleimhaut des Darms). Aus Mycoplasma genitalium wurde das Genom sequenziert, es ist 580 kb groß und enthält nur ca. 500 Gene. In der Gramfärbung reagieren die Mykoplasmen variabel. Sie sind gegenüber Penicillinen und Sulfonamiden resistent, nicht jedoch gegen Tetrazykline und Streptomyzin.
Pilze
Pilze (Mycobionta, Fungi) sind eine sehr heterogene Gruppe in vielen Formen und Farben ubiquitär vorkommender eukaryontischer Lebewesen mit mehr als 110 000 Arten; sie lassen sich in vier Gruppen einteilen: Ständerpilze (Basidiomycota) mit ca. 30 000 Spezies, Schlauchpilze (Ascomycota) mit ca. 46 000 Spezies (darunter ca. 1000 Arten von Hefen oder Endomycetes), Jochpilze (Zygomycota) mit ca. 650 Spezies und Fungi imperfecti (oder Deuteromycota) mit ca. 30 000 Spezies. Nahezu alle human- und tierpathogenen Pilze sowie die meisten Schimmelpilze gehören in diese letzte Gruppe [13]. Aus Pilzen besteht schätzungsweise 25% der Biomasse unserer Erde. Pilze können sogar optische Linsen in Objektiven besiedeln. Ungefähr 300 Arten sind humanpathogen [9], jedoch gehen die meisten Erkrankungen von Kulturpflanzen auf Pilze zurück. Pilze können Toxine produzieren (bisher sind mehr als 500 Mykotoxine bekannt), die für Mensch und Tier zum Teil letal sind (in Deutschland sterben jährlich ca. 50 Menschen an den Folgen von Pilzvergiftungen). Außerdem können toxische und kanzerogene Stoffwechselprodukte, vor allem von Schimmelpilzen, produziert werden: Aflatoxine, Ochratoxine, Patuline, Fusariumtoxine. Die Food and Agricultural Organization schätzt, dass bis zu einem Viertel der Weltproduktion von Nahrungsmitteln mit Mykotoxinen verunreinigt sind. Das allergene Potenzial der Pilze wird dagegen bisher als gering eingestuft.
Abb. 1.1 Weiße Schimmelpilze auf feuchtem Möbelholz im Keller, nach einem Eindringen von Regenwasser.
Gemeinsam ist allen Pilzen eine starre Zellwand, die Chitin (ein Polysaccharid), Zellulose, Glucane usw. enthält, und der echte Zellkern. Pilze können keine Fotosynthese durchführen und ernähren sich von fertigen organischen Substanzen: Sie sind C-heterotroph. Pilze ernähren sich entweder von totem organischem Material (siehe Abb. 1.2) oder leben als parasitär auf oder in anderen Lebewesen. Pilze haben eine ungeschlechtliche, zum Teil auch sexuelle Vermehrung. Bei den Fungi imperfecti kennt man nur eine ungeschlechtliche Vermehrung, beispielsweise durch Sprossung oder Konidiosporen. Pilze sind einzellig (z. B. Sprosspilze wie die Bierhefe Saccharomyces cerevisiae sowie die verschiedenen Candidaarten) oder mehrzellig (z. B. Erreger von Dermatomykosen); die Pilzzellen sind deutlich größer als Bakterienzellen. Sprosspilze können bei Schwerkranken z. B. auf der Zunge, im Rachen, in den Bronchien und in der Speiseröhre auftreten. Es gibt außerdem gefährliche Erkrankungen der Hirnhaut, der Lunge, der Niere, des Darms und anderer Organe. Im Krankenhaus gefürchtet ist die Aspergillose, hervorgerufen durch Aspergillus fumigatus: Diese Infektionskrankheit hat die schlechteste Prognose überhaupt [14]. In der Natur lebt der Pilz auf abgestorbenen Pflanzen, in Komposthaufen, Biotonnen, Getreide, Heu, Teeblättern und Nüssen. Die Pilzsporen werden über die Lunge eingeatmet. Bei gesunden Menschen werden die Sporen von den Makrophagen vernichtet, bei immunsupprimierten Patienten dagegen funktioniert die Abwehr nicht und die Pilze werden über die Blutbahn zu den verschiedenen Organen transportiert. Die Letalität ist hoch, ca. 2/3 der Infizierten sterben, das sind in Deutschland jedes Jahr ungefähr 2500 Menschen.
Abb. 1.2Aspergillus niger auf Agarplatte, REM-Aufnahme. Mit freundlicher Genehmigung von Manfred Rohde (HZI), Braunschweig.
Tab. 1.3Lebensbereich für Schimmelpilze. Im mit X gekennzeichneten Bereich ist das Wachstum der Schimmelpilze optimal.
Zunahme der relativen Luftfeuchte [% r.F.] →
Temperatur [ °C]
60
70
75
80
85
90
95
100
pH-Wert
80
12
70
×
×
×
×
×
×
×
11
60
×
×
×
×
×
×
×
10
50
×
×
×
×
×
×
×
9
40
×
×
×
×
×
×
×
8
30
×
×
×
×
×
×
×
7
20
×
×
×
×
×
×
×
6
10
×
×
×
×
×
×
×
5
0
×
×
×
×
×
×
×
4
Zunahme des Nährstoffangebots →
Hautpilze gehören verschiedenen Arten an und sind wie Sprosspilze sehr schwer zu bekämpfen. Pilze können sich z. B. in Badeanstalten an feuchten Stellen vermehren.
Weitere Pilzerkrankungen sind die Lebertumore, die durch Pilzstoffwechselprodukte (Aflatoxine, Patuline) verursacht werden. Aflatoxinhaltig können verschimmelte Lebensmittel, patulinhaltig verdorbene Äpfel und Säfte sein.
Wie bei den Lebensmitteln ist auch eine Schimmelbildung bei Arzneimitteln möglich, besonders dann, wenn sie unsachgemäß gelagert werden. Eine besondere Gefahr stellen Wände mit Schimmelbildung dar, denn in solchen Räumen kann ein messbar erhöhter Pilzsporengehalt der Luft festgestellt werden. Dies ist sowohl eine Gefahr für die Menschen, die sich in solchen Räumen aufhalten müssen, als auch für die Arzneimittel, die in solchen Räumen hergestellt bzw. gelagert werden.
Protozoen
Diese Gruppe umfasst frei oder parasitisch lebende, einzellige Eukaryonten mit den meisten Merkmalen tierischer Zellen. Die Vermehrung findet meist durch Zweiteilung statt. Die Übertragung parasitischer Protozoen auf den Menschen erfolgt oft durch Arthropoden: Der Erreger der Malaria (Plasmodium) wird durch Anophelesmücken übertragen, der Erreger der Schlafkrankheit (Trypanosoma brucei) durch Tsetsefliegen (Glossina ssp.). Die Schlafkrankheit gehört zu den wenigen Infektionskrankheiten mit einer 100%igen Letalität.
1.4 Die Bakterienzelle
Das durchschnittliche Gewicht einer Bakterienzelle ist mit ca. 10−12 g weniger als ein Tausendstel des Zellgewichts einer Tierzelle [15], auch ist sie deutlich kleiner als die Eukaryontenzelle. Die Bakterienzelle setzt sich aus den folgenden Bestandteilen zusammen:
Prokaryonte Kernsubstanz (Nukleoid)
Das Nukleoid ist ein nacktes, aufgeknäueltes, nach rechts gewundenes, meist zirkuläres DNA-Molekül mit einer molaren Masse von etwa 2,5 × 109 Da. Bei Querteilung erfolgt immer erst die Verdoppelung des Nukleoids.
Plasmide
Plasmide bestehen aus extrachromosomaler DNA. Zwischen 1 und 5 % der genetischen Information der Bakterienzelle kann plasmidcodiert sein. Von medizinischer Bedeutung sind die Resistenzplasmide (R-Plasmide), die Gene enthalten, die für Resistenz gegenüber Antibiotika sorgen. Die F-Plasmide tragen Fertilitätsfaktoren.
Zytoplasma
Das Zytoplasma enthält viele in Wasser gelöste Stoffe (Proteine und Mineralstoffe) und die 70S-Ribosomen. Die Ribosomen sind für die Proteinsynthese verantwortlich. Ihre Anzahl beträgt bei schnell wachsenden Bakterien ungefähr 20 000, ihre Größe 20–24 nm, ihre Sedimentationsgeschwindigkeit in der Ultrazentrifuge beträgt 70 Svedberg-Einheiten.
Reservestoffe
Zu den Reservestoffen gehören Polyphosphate (Volutin), Poly-β-hydroxy-Buttersäure (PHB), Glykogen (bei Bacillus-Arten und Enterobakterien) und Lipidtropfen.
Reservestoffe werden unter bestimmten Milieubedingungen gebildet und in Mangelsituationen wieder genutzt.
Zytoplasmamembran
Diese semipermeable Elementarmembran besteht aus einer Phospholipiddoppelschicht, in die gefaltete Proteinmoleküle eingebettet sind.
Zellwand
Sie ist 10–80 nm dick, gibt den Bakterien eine feste Form und bildet eine elastische Schutzhülle gegen äußere Verletzungen. Der Innendruck kann zwischen 500 und 2000 kPa betragen [9]. Die Zellwand ist permeabel, d. h. für Nahrungsstoffe weitgehend durchlässig. Der chemische Aufbau der Zellwand ist bei gramnegativen und grampositiven Bakterien verschieden. Bei grampositiven Keimen besteht die Zellwand aus viel Murein (Mukopolysaccharid durch Peptide quervernetzt). Die Dicke der Zellwand beträgt 15–80 nm. Die Zellwand macht 30 % der Trockenmasse aus. Bei gramnegativen Bakterien ist nur wenig Murein vorhanden, jedoch viele Proteine und Phospholipide. Die Dicke liegt hier um 10 nm.
Kapsel
Viele Bakterien bilden in vivo mithilfe extrazellulärer Enzyme außerhalb der Zelle eine Kapsel aus Polysaccharidpolymer (Ausnahme Bacillus anthracis: D-Glutaminsäure). Die Kapsel schützt weitgehend vor Phagozytose (= Aufnahme durch weiße Blutzellen) und damit vor unspezifischer Infektionsabwehr.
Geißeln
Die meisten beweglichen Bakterien besitzen Geißeln. Diese sind aus dem linearen Protein Flagellin aufgebaut. Geißeln sind über eine komplexe Struktur in der Zellhülle verankert und in der Lage, um ihre Achse zu rotieren (mit Frequenzen bis 300 Hz), wodurch eine Vorwärtsbewegung zustande kommt. In Wasser können Bakterien so mit bis zu 100 μm s−1 vorankommen. Escherichia coli besitzt vier bis sechs Geißeln, deren Längen bis 45 μm lang sein können [16].
Die Geißeln können
monotrich (z. B. Vibrio),
lophotrich (z. B. Pseudomonas) oder
peritrich (z. B. Salmonella)
angeordnet sein.
Fimbrien und Pili
Viele Bakterien bilden Oberflächenstrukturen, die kürzer und feiner sind als Geißeln. Fimbrien sind zuständig für die Anlagerung an spezifische Rezeptoren von Wirtszellen. Sexpili sind fädige Proteinhohlrohre, die für den Zell-zu-Zell-Kontakt bei der Konjugation (Übertragung von DNA) verantwortlich sind. Die Pili sind 0,2–1,2 μm lang und 10 nm dick [16].
Endotoxine
Endotoxine sind Lipopolysaccharide (LPS), die in der äußeren Membran der Zellwand gramnegativer Bakterien lokalisiert sind. Sie gelangen durch Abgabe von Membranvesikeln durch lebende Bakterien oder beim Absterben der Bakterienzelle ins Milieu. Endotoxine wirken fiebererzeugend (= pyrogen) in Menschen und in vielen Säugetieren (Kaninchen, Hunde u. a.), nicht jedoch beispielsweise in Vögeln.
1.4.1 Bakterienmorphologie
Die Größenordnung von Bakterien und anderen Mikroorganismen ist in Tab. 1.2 wiedergegeben. In der belebten Natur bewegt sich die Größe aller Lebewesen zwischen 0,3 μm (kleinste Bakterien wie Corynebacterium diphtheriae, dem Erreger der Diphtherie, oder wie Brevundimonas diminuta, einem stäbchenförmigen Wasserbakterium) und dem Hallimaschpilz (Armillaria ostoyae), dessen Myzelausdehnung unter der Erde 600 ha beträgt, entdeckt 1992 im US-Bundesstaat Washington [6].
Bakterienformen
Bakterienzellen können in den folgenden Formen auftreten: Kokken allein oder in Haufen, Trauben, Ketten oder als semmelförmige oder lanzettförmige Diplokokken (letztere mit Kapsel), gerade Stäbchen abgerundet, gerade Stäbchen eckig, keulenförmige Stäbchen, Stäbchen mit zugespitzten Enden, einfach gekrümmte Stäbchen oder spiralenförmige Stäbchen.
Endosporen
Bakterielle Endosporen sind keine Vermehrungsformen wie die Pilzsporen, sondern Dauerformen bei einigen aeroben und anaeroben Bakteriengattungen; sie schützen das bakterielle Genom bei ungünstigen Bedingungen. An der Sporulation sind mehr als 200 Gene beteiligt. Zur Sporenbildung sind die weitverbreiteten Gattungen Bacillus, Geobacillus, Paenibacillus, Sporolactobacillus, Sporosarcina, Sporobacter, Sporotomaculum, Halobacillus, Thermoactinomyces, Thermoanaerobacter, Desulfotomaculum und Clostridium, insgesamt über 30 Gattungen, befähigt. Die tierpathogenen Gattungen Actinobacillus und Streptobacillus vermögen keine Endosporen zu bilden (der Namenszusatz „-bacillus“ verführt zu dieser Annahme).
Die Bildung einer Endospore beginnt in der vegetativen Zelle, wenn die Umgebungsbedingungen widrig werden. Zur Sporulation verdichtet sich die Trockensubstanz der Zelle auf 1/10 ihres Volumens zu einem Sporenprotoplasten. Die verdoppelt umhüllende Zytoplasmamembran bildet die Sporenwand. Im Endstadium lösen sich die Reste der vegetativen Zelle auf. Die Endosporen besitzen erhebliche Resistenz gegenüber Desinfektionsmitteln und hohen Temperaturen. Endosporen können jahre- bis jahrzehntelang lebensfähig bleiben.
Als Ursachen für die Hitzeresistenz sind die dicke Sporenwand sowie die Wasserarmut, die eine Denaturierung der Proteine erschwert, verantwortlich zu machen.
Gerät die Endospore in für das Leben der Bakterien günstige Umgebungsbedingungen, so erfolgt die Rückwandlung in die vegetative Zellform.
Mögliche Lagen der Endosporen sind:
Sporenbildung zentral, ohne Auftreibung der vegetativen Zelle,
Sporenbildung terminal, ohne Auftreibung der vegetativen Zelle,
Sporenbildung terminal, mit Auftreibung der vegetativen Zelle,
Sporenbildung zentral, mit Auftreibung der vegetativen Zelle,
freigesetzte Sporen.
1.4.2 Bakterienphysiologie
Der Stoffwechsel sowie das Wachstum und Überleben der Bakterien werden, genau wie bei den höheren Organismen, von einer Vielzahl von Umweltfaktoren beeinflusst.
Abb. 1.3Sporenfärbung bei Bacillus cereus. Die Sporen sind grün, die vegetativen Zellen rot gefärbt. Vergrößerung 1000×, Immersionsöl. Mit freundlicher Genehmigung von Matthias Nagel, Bremerhaven.
1.4.2.1 Ernährung und Stoffwechsel
Die Grundbedürfnisse der Bakterien sind jenen der höheren Lebewesen sehr ähnlich. Sie benötigen:
eine Energiequelle für den Stoffwechsel,
eine Kohlenstoffquelle für den Aufbau von Proteinen, Polysacchariden, Nukleinsäuren,
eine Stickstoffquelle für den Aufbau von Proteinen, Polysacchariden, Nukleinsäuren,
eine Phosphatquelle für den Aufbau von ATP, Nukleotiden, Nukleinsäuren, Phospholipiden,
eine Schwefelquelle für den Aufbau der Aminosäuren Cystein und Methionin, sowie für Thiaminpyrophosphat, Coenzym A, Biotin,
α
-Liponsäure
eine Reihe von anorganischen Salzen und Spurenelementen für Enzyme
Vitamine und andere Wachstumsfaktoren.
Beim Stoffwechsel unterscheidet man zwischen einem aufbauenden Stoffwechsel (= Anabolismus oder Assimilation) und einem abbauenden Stoffwechsel (= Katabolismus oder Dissimilation
